FAK抑制剂对肝癌HCC-LM3细胞骨架重排和侵袭的作用机制

姚红兵，肖 芳，郭 威，吴嘉兴，文雪霖，蒋建晖，华赟鹏

（1.桂林医学院第二附属医院肝胆外科，广西桂林 541199；2.解放军联勤保障部队第924医院肿瘤科，广西桂林 541002；3.中山大学附属第一医院肝外科，广东广州 510080）

肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，其病情进展迅速，待临床确诊时大部分已为肝癌晚期。侵袭转移是促进其病情进展的主要原因之一，也是肝癌治疗预后差的主要因素［1］，因此干预转移相关的靶分子已成为肝癌研究领域的重点。黏着斑激酶（focaladhesionkinase，FAK）是一种非受体酪氨酸激酶，既往研究表明，FAK可通过PI3K/Akt通路调节肿瘤细胞黏附、侵袭、迁移等过程，是肿瘤发生发展的重要调控因子之一［2］。CT-707 是一种新型的FAK 激酶抑制剂，具有良好的抗肝癌细胞增殖作用［3］。本课题组前期研究表明，CT-707 在肝癌动物模型中可抑制肝癌细胞的增殖以及肿瘤形成，促进癌细胞的凋亡［4］，但相应机制尚需深入研究。故本研究拟选取人高转移性肝癌细胞HCC-LM3和裸鼠为研究对象，基于FAK/PI3K/Akt通路，进一步探讨CT-707对肝癌细胞侵袭、迁移能力以及肿瘤生长的影响和机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞及动物 人肝癌细胞系HCC-LM3由上海生命科学院细胞所提供。12只BALB/c裸鼠购自上海林畅生物有限公司，均为6 周龄雌性，于SPF级条件下饲养。实验均通过我院伦理委员会审核、批准。

1.1.2 主要试剂和仪器 DMEM（Hyclone SH30023.01），胎牛血清（Hyclone SH30070.03），青链霉素混合液（Solarbio，P1400），逆转录试剂盒（Takara，RR047a），SYBR Green qPCRMix（Monad，MQ10301），TRIzol Reagent（Invitrogen，15596026），BCA 蛋白定量试剂盒（Solarbio PC0020），ECL 化学发光底物（超敏）（Biosharp BL523A），Transwell小室（Corning，3422），CT-707（MCE HY-109084），Anti-Palladin antibody（abcam，ab169051），Anti-Vimentin antibody（abcam，ab92547），Anti-MMP2 antibody（abcam，ab97779），Anti-MMP9 antibody（abcam，ab38898），Anti-p-FAK antibody（abcam，ab81298），Anti-FAK antibody（abcam，ab40794），Anti-p-PI3K antibody（CST17366），Anti-PI3K antibody（abcam，ab70912），Anti-p-Akt antibody（CST4060），Anti-Akt antibody（abcam，ab179463），β-actin（abcam，ab8227），MTT（Solarbio，M1020），HE 染色试剂盒（Solarbio G1121）。主要仪器：电泳转膜仪（Bio-Rad PowerPac Basic）、多功能酶标仪（美国MD FilterMax F3）、凝胶成像系统（上海天能Tanon 5200）、实时荧光定量PCR 仪（Agilent Technologies，G8830-64001）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 肝癌细胞系HCC-LM3 采用含10 g/L胎牛血清和1%双抗（青霉素100 U/mL，链霉素0.1mg/mL）的DMEM，于37 ℃，体积分数5% CO2培养箱中培养，隔日传代，选取生长状态量好的细胞接种于6 孔板中，待细胞融合至60%～70%时，进行实验。

1.2.2 分组及给药 HCC-LM3 分为Control 组、CT-707 低剂量（1.5 μmol/L）组、CT-707 中剂量（3 μmol/L）组、CT-707 高剂量（6 μmol/L）组。细胞给药前换入无血清DMEM 去血清同步化24 h，根据实验分组，加入相应剂量的含药DMEM，于37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中培养48 h。

1.2.3 Transwell 将Matrigel 胶于4 ℃过夜融化，与无血清培养基以2：1体积比混匀，吸取200 μL混合液铺于Transwel 小室上室，培养箱放置至基质胶凝固。将给药处理后的HCC-LM3 从培养箱取出，消化离心后收集，采用DMEM 重悬，调整细胞浓度为5×105个/mL，取200 μL 细胞悬液加入上室。在下室加入500 μL DMEM 全培养基，放置培养箱中孵育48 h。采用40 g/L 多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色15 min，棉签擦掉上室细胞，显微镜下拍照并进行计数，侵袭细胞数取均值。

1.2.4 细胞划痕实验 对数生长期的HCC-LM3按每孔5×105个接种于6 孔板中，培养至细胞单层铺满板底，用200 μL 无菌枪头，垂直于板底进行划痕，采用PBS 清洗去除划下的细胞。细胞经CT-707干预后，倒置显微镜下拍照，并计算迁移距离。

1.2.5 MTT 实验 各组对数期细胞种植于96 孔板，每孔180 μL，3 000～10 000 个细胞/孔。置37 ℃、体积分数5% CO2温箱培养使细胞贴壁，培养24 h 细胞贴壁后加入含不同剂量的CT-707 培养，对照组加入空白培养液。培养箱内孵育48 h后，弃去培养液，加入90 μL 培养液，再加入10 μL MTT 溶液，继续培养4 h。然后吸掉上清，每孔加入110 μL Formazan 溶解液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm 处测量各孔的吸光值（OD 值）。按下列算式计算细胞活力：细胞活力（%）=（加药孔平均OD值－空白孔平均OD 值）/（对照孔平均OD 值－空白孔平均OD 值）×100%。

1.2.6 RT-qPCR HCC-LM3 细胞经CT-707 干预后，弃去培养基，PBS 清洗2 次，TRIzol 法提取细胞总RNA，根据逆转录试剂盒操作说明进行逆转录，合成cDNA 后进行PCR 反应。逆转录条件为37 ℃15 min，85 ℃5 min。反应体系为20 μL，扩增条件为95 ℃变性2 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火延伸30 s，45 个循环后，72 ℃延伸10 min。PCR 引物见表1，以β-actin 为内参，通过2-△△Ct相对定量法计算各基因相对表达水平。

表1 引物序列Table 1 Sequences of the primers

1.2.7 Western blot HCC-LM3 细胞经CT-707 干预后，加入300 μL RIPA 细胞裂解液后用刮刀刮取细胞，置冰上30 min 后，低温离心20 min，取上清。BCA 法进行蛋白定量，以每泳道20 μg 进行样品配置，100 ℃变性10 min。SDS 电泳，湿法转膜，用5%脱脂奶粉进行封闭，分别加入相应一抗，4 ℃过夜孵育，TBST 洗膜3 次，加入相应属源辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL荧光显色，采用凝胶成像系统进行拍照，Image J 软件对条带进行灰度值分析。

1.2.8 裸鼠皮下移植瘤模型建立及药物治疗 将对数生长期的HCC-LM3 消化、离心、重悬，制成2.0×107/mL悬液，在常规消毒的裸鼠腋部皮肤行皮下注射细胞悬液0.2 mL。根据实验动物3R 原则，将接种HCC-LM3细胞悬液的裸鼠随机分为模型组及CT-707 组，每组6 只。CT-707 组按照20 mg/kg剂量腹腔注射给药，间隔1 d 注射1 次，模型组则不做任何处理。分别于给药后9、18、27、36 和45 d 测定瘤体最长直径（a）和最短直径（b），计算移植瘤的体积（V/mm3）=（l/2）×a×b2。给药45 d 后处死动物，取出移植瘤组织进行称重，计算抑瘤率（%）=［（模型组平均瘤体质量-CT-707 组平均瘤体质量）/模型组平均瘤体质量］×100%。将取出的肿瘤组织于40 g/L多聚甲醛中固定，行石蜡切片。

1.2.9 HE 染色 取各组移植瘤组织石蜡切片行HE染色。根据试剂盒说明书操作：二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，蒸馏水浸洗5 min；苏木精染色5 min，冲洗残留染液；滴加体积分数1%盐酸酒精进行分化，冲洗；滴加体积分数1%氨水反蓝，冲洗；浸入伊红染液中染色5 min，冲洗；依次进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。切片晾干后镜检、拍照。

1.2.10 免疫组化 取各组移植瘤石蜡切片，脱蜡，微波抗原修复后，滴加体积分数3%H2O2，蒸馏水冲洗干净。滴加封闭液室温孵育，加入一抗4 ℃过夜孵育。弃去一抗，PBS 冲洗，滴加生物素标记的二抗，室温孵育20 min，PBS 冲洗。滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育20 min，PBS 清洗，DAB显色，终止，自来水反复冲洗，苏木素复染。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察并拍照，Image J 软件分析FAK、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9的阳性表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行数据统计分析，符合正态分布的计量资料以（）表示，二组计量资料的均数比较，如果每一组资料都呈正态分布并且方差齐性，组间比较采用t检验，多组均数比较，各组定量资料都呈正态分布并且方差齐性采用单因素方差分析，差异有统计学意义时采用LSD-t检验进行两两比较。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CT-707对肝癌细胞活性、侵袭、迁移的作用

采用MTT、Transwell小室及细胞划痕实验检测肝癌细胞活力、侵袭及迁移能力。结果显示，与Control 组比较，CT-707 高、中、低剂量干预HCCLM3 细胞可显著抑制HCC-LM3 细胞侵袭（F=22.139，P=0.000）、迁移能力（F=35.987，P=0.000），降低细胞活力（F=43.481，P=0.000；P＜0.05），中、高剂量组的效应明显优于低剂量组（P＜0.05），中、高剂量组间结果差异无统计学意义（P＞0.05）。相较于Control 组，CT-707 低剂量组的细胞活力（P=0.005）、侵袭能力（P=0.027）和迁移能力（P=0.007）均显著降低，CT707 中剂量组的细胞活力（P=0.000）、侵袭能力（P=0.000）和迁移能力（P=0.000）均显著降低，CT707 高剂量组的细胞活力（P=0.000）、侵袭能力（P=0.000）和迁移能力（P=0.000）均显著降低。相较于CT-707 低剂量组，CT707 中剂量组的细胞活力（P=0.000）、侵袭能力（P=0.001）和迁移能力（P=0.000）均显著降低，CT707 高剂量组的细胞活力（P=0.000）、侵袭能力（P=0.000）和迁移能力（P=0.000）均显著降低。相较于CT-707 中剂量组，CT707 高剂量组的细胞活力（P=0.283）、侵袭能力（P=0.707）和迁移能力（P=0.869）差异均无统计学意义（图1）。

图1 CT-707对HCC-LM3细胞活性、侵袭及迁移的影响Fig.1 The effect of CT-707 on the invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells

2.2 CT-707 对肝癌细胞骨架蛋白及基质金属蛋白的作用

采用qPCR 及Western blot 检测细胞骨架蛋白（Palladin、Vimentin）和基质金属蛋白酶（MMP2 和MMP9）的表达水平。结果显示，HCC-LM3 经高、中、低剂量处理后，与Control 组比较，Palladin（mRNA：F=14.454，P=0.000，protein：F=14.311，P=0.000）、Vimentin（mRNA：F=31.711，P=0.000，protein：F=21.025，P=0.000）、MMP2（mRNA：F=45.341，P=0.000，protein：F=18.685，P=0.000）和MMP9（mRNA：F=21.953，P=0.000，protein：F=15.031，P=0.000）的表达均显著降低（P＜0.05），中、高剂量组的效应明显优于低剂量组（P＜0.05），中、高剂量组间结果差异无统计学意义（P＞0.05）。

相较于Control 组，CT-707 低剂量组的Palladin（mRNA：P=0.032，protein：P=0.011）、Vimentin（mRNA：P=0.043，protein：P=0.001）、MMP2（mRNA：，P=0.000，protein：P=0.002）和MMP9（mRNA：P=0.001，protein：P=0.006）的表达均显著降低，CT707 中剂量组的Palladin（mRNA：P=0.000，protein：P=0.000）、Vimentin（mRNA：P=0.003，protein：P=0.000）、MMP2（mRNA：，P=0.000，protein：P=0.000）和MMP9（mRNA：P=0.000，protein：P=0.000）的表达均显著降低，CT707 高剂量组的Palladin（mRNA：P=0.000，protein：P=0.000）、Vimentin（mRNA：P=0.002，protein：P=0.000）、MMP2（mRNA：，P=0.000，protein：P=0.000）和MMP9（mRNA：P=0.000，protein：P=0.000）的表达均显著降低。

相较于CT-707 低剂量组，CT707 中剂量组的Palladin（mRNA：P=0.020，protein：P=0.013）、Vimentin（mRNA：P=0.012，protein：P=0.009）、MMP2（mRNA：，P=0.000，protein：P=0.018）和MMP9（mRNA：P=0.023，protein：P=0.018）的表达均显著降低，CT707 高剂量组的Palladin（mRNA：P=0.002，protein：P=0.018）、Vimentin（mRNA：P=0.001，protein：P=0.010）、MMP2（mRNA：，P=0.000，protein：P=0.014）和MMP9（mRNA：P=0.003，protein：P=0.019）的表达均显著降低。

相较于CT-707 中剂量组，CT707 高剂量组的Palladin（mRNA：P=0.304，protein：P=0.089）、Vimentin（mRNA：P=0.675，protein：P=0.965）、MMP2（mRNA：，P=0.300，protein：P=0.895）和MMP9（mRNA：P=0.330，protein：P=0.986）的表达差异均无统计学意义（图2）。

图2 CT-707对HCC-LM3细胞Palladin、Vimentin、MMP2 和MMP9蛋白的作用Fig.2 The effect of CT-707 on the Palladin，Vimentin，MMP2 and MMP9 protein of LM3 cells

2.3 CT-707对FAK/PI3K/Akt信号通路的影响

采用Western blot 检测FAK、PI3K 和Akt 蛋白及其磷酸化表达水平。结果表明，HCC-LM3经高、中、低剂量处理后，与Control 组比较，p-FAK/FAK（F=90.258，P=0.000）、p-PI3K/PI3K（F=90.909，P=0.000）、p-Akt/Akt 均显著下调（F=115.559，P=0.000；P＜0.05），中、高剂量组的效应明显优于低剂量组（P＜0.05），中、高剂量组间结果无统计学差异（P＞0.05）。相较于Control 组，CT-707 低剂量组的p-FAK/FAK（P=0.000）、p-PI3K/PI3K（P=0.000）、p-Akt/Akt（P=0.000）均显著降低，CT707 中剂量组的p-FAK/FAK（P=0.000）、p-PI3K/PI3K（P=0.000）、p-Akt/Akt（P=0.000）均显著降低，CT707 高剂量组的p-FAK/FAK（P=0.000）、p-PI3K/PI3K（P=0.000）、p-Akt/Akt（P=0.000）均显著降低。相较于CT-707 低剂量组，CT707 中剂量组的p-FAK/FAK（P=0.000）、p-PI3K/PI3K（P=0.000）、p-Akt/Akt（P=0.000）均显著降低，CT707 高剂量组的p-FAK/FAK（P=0.000）、p-PI3K/PI3K（P=0.000）、p-Akt/Akt（P=0.000）均显著降低。相较于CT-707中剂量组，CT707高剂量组的p-FAK/FAK（P=0.416）、p-PI3K/PI3K（P=0.132）、p-Akt/Akt（P=0.270）差异均无统计学意义（图3）。

图3 CT-707对HCC-LM3细胞中FAK/PI3K/Akt信号通路的影响Fig.3 The effect of CT-707 on the FAK/PI3K/Akt pathway

2.4 CT-707对裸鼠皮下移植瘤生长的影响

通过计算裸鼠移植瘤体积及质量，结果显示，与模型组相比，CT-707 组移植瘤体积［27 d（t=3.030，P=0.013），36 d（t=7.056，P=0.000），45 d（t=8.461，P=0.000）］和质量（t=10.510，P=0.000）显著降低（P＜0.05；图4），抑瘤率为51.92%；HE 染色结果显示，模型组肿瘤细胞排列紧密、整齐，细胞核清晰可见，CT-707 组肿瘤组织坏死增多，肿瘤细胞核消失，细胞排列松散。

图4 CT-707对裸鼠皮下移植瘤生长的影响Fig.4 The effect of CT-707 on the growth of subcutaneously transplanted tumors in nude mice

2.5 CT-707 对裸鼠皮下移植瘤FAK/PI3K/Akt 通路关键因子表达的影响

采用免疫组化检测裸鼠皮下移植瘤中FAK、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9蛋白的阳性表达，结果显示，相较于模型组，CT-707 组FAK（t=5.426，P=0.000）、PI3K（t=7.731，P=0.000）、p-Akt（t=5.930，P=0.000）、MMP-2（t=7.965，P=0.000）、MMP-9（t=7.525，P=0.000）蛋白表达均显著降低（P＜0.05；图5）。

图5 FAK、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9蛋白的免疫组化检测结果Fig.5 Immunohistochemical results of FAK，PI3K，p-Akt，MMP-2，MMP-9 proteins

3 讨论

肝癌是我国位列第四的常见恶性肿瘤，且在癌症相关死亡原因中位列第三，该病发病率和死亡率较高，严重影响患者的生活质量及总体生存期［5］。肿瘤的复发和转移是导致肝癌治疗失败和死亡的主要原因［6］。肿瘤的转移是肿瘤细胞脱离原发部位，降解周围基底膜从而穿过血管壁或淋巴管壁，随血液或淋巴液运行并聚集于相应器官，在转移器官内生长增殖，最终形成继发性肿瘤的多步骤过程［7］。肝癌恶性程度高，病情进展迅速，临床确诊大多已处于进展期或晚期，多伴有远端转移及癌栓，术后五年生存率仅为12%～14%。随着肿瘤靶向药物的开发使用，寻求靶向肿瘤侵袭迁移相关蛋白的药物已成为肿瘤研究热点。

据报道，FAK在包括肝癌在内的多种肿瘤组织内高表达，且与肝癌细胞的黏附、播散、迁移和侵袭能力呈正相关［8］。FAK 参与整合素依赖性信号通路，作为胞内信号传导分子，介导细胞内多条信号通路及信号通路的交联反应，进而调节肿瘤细胞的恶性表型和侵袭转移行为［9］。故抑制FAK 的表达及其下游与肿瘤相关的传导通路，是降低肝癌细胞的侵袭迁移能力的重要策略。目前，开发靶向FAK的抑制剂是新型抗肿瘤药物研发的重要领域［10］。其中CT-707 是一种结构新颖的靶向FAK、ALK 和Pyk2 的多重激酶抑制剂，在促进癌细胞分离实验中呈现良好效果，且与卡博替尼联合使用治疗肝癌，具有协同抗肿瘤作用，其机制为显著抑制由卡博替尼诱导的FAK 磷酸化激活［11］。本研究选取高转移潜能的细胞系HCC-LM3进行CT-707干预，发现CT-707 可显著抑制HCC-LM3 侵袭、迁移能力，降低癌细胞活力，表明CT-707对肝癌细胞的侵袭、迁移具有明显的抑制作用。另外，在裸鼠皮下移植瘤模型中，我们发现CT-707 治疗后可显著降低肿瘤体积及质量，抑瘤率为51.92%，且移植瘤细胞坏死增多，排列松散，进一步证实CT-707可有效抑制肿瘤生长。

肿瘤细胞的侵袭和迁移涉及细胞骨架聚集、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）异常分泌等细胞活动。支架蛋白Palladin和波形蛋白Vimentin 是细胞骨架的重要组成部分，与细胞骨架和细胞形态的改变密切相关。研究表明，Palladin在多种癌细胞中高表达，通过调控伪足的形成，影响癌细胞的迁移侵袭，从而促进肿瘤的转移［12］。而Vimentin 的表达水平与肝癌细胞的转移能力呈正相关，在肿瘤细胞增殖、迁移和黏附中有具有关键作用，并与癌症的复发密切相关［13］。MMPs 是一类能降解细胞外基质的高度保守蛋白水解酶，在肿瘤的侵袭转移中具有重要意义，可通过降解破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质，使肿瘤细胞向周围组织浸润，最终导致肿瘤局部侵袭和远端转移［14］。其中，MMP2 和MMP9 在肝癌组织中高表达，通过调节肝癌细胞和基质的黏附等方式加速肝癌的侵袭转移［15-16］。因此，本研究选取Palladin、Vimentin、MMP2 及MMP9 作为肝癌细胞发生侵袭转移的标志蛋白。HCC-LM3 细胞经CT-707 干预后，Palladin、Vimentin、MMP2 及MMP9 蛋白表达均显著下调，且动物实验也显示裸鼠移植瘤模型经CT-707治疗后，显著降低了肿瘤组织中MMP2 及MMP9 阳性表达，表明CT-707可通过降低骨架蛋白及MMPs的表达，进而降低细胞的侵袭及迁移能力，从而发挥抑癌作用。

FAK 可通过多条信号通路参与细胞骨架重排及MMPs 的分泌过程，其中PI3K/Akt是FAK 经典下游通路，参与调控肿瘤的增殖、黏附及迁移，在肝癌的发生发展过程中发挥重要作用［17］。Palladin、Vimentin 是Akt 下游蛋白，激活Akt 可直接促进Palladin、Vimentin 的表达［18-19］。研究表明，抑制PI3K/Akt 信号通路还可进一步抑制MMP2、MMP9 的表达，抑制肝癌细胞侵袭迁移［20］。由此，我们推测CT-707可能通过调控FAK/PI3K/Akt信号通路活性从而抑制肝癌细胞侵袭迁移。通过进一步实验，本研究发现HCC-LM3 细胞经CT-707 干预后，p-FAK/FAK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 均显著下降，表明抑制FAK/PI3K/Akt 信号通路活性是CT-707 发挥抑癌作用的关键机制。为了进一步验证CT-707抑制肝癌细胞侵袭、转移的机制，我们进行了裸鼠皮下成瘤实验，发现模型鼠经CT-707 治疗后，FAK、PI3K、p-Akt 蛋白表达均显著降低，表明CT-707 可通过抑制FAK/PI3K/Akt 信号通路活性进而抑制肿瘤的形成。

综上所述，本研究证实FAK 新型抑制剂CT-707 可抑制肝癌细胞的侵袭、迁移以及肿瘤生长，其机制为抑制FAK/PI3K/Akt 信号通路活性，从而抑制细胞骨架重排及MMPs 分泌，表明CT-707 作为一种FAK 靶向抑制剂具有良好的癌细抑制作用，可能是潜在的肿瘤靶向药物，值得深入研究。