SDF-1/CXCR4激活ERK和PI3K/AKT通路介导髓核致炎根性疼痛

魏 明，高凤娇，杨 琳，孙来保，邹学农，黄文起

（1.中山大学附属第一医院麻醉科，广东广州 510080；2.番禺区中心医院麻醉科，广东广州 511400；3.广东省骨科学重点实验室，广东广州 510700）

根性疼痛是指脊神经的背根和/或背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）受到刺激而引起的疼痛。它是腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation，LDH）最常见的临床症状［1］。LDH 导致根性疼痛的机制有机械压迫学说、炎症免疫学说等，其中炎症免疫学说越来越受到重视。突出的髓核组织可引起化学刺激，并诱发炎症免疫反应产生IL-6、IL-1β、TNF-α 等细胞因子，刺激传入神经纤维，导致痛觉的外周敏化；同时这些因子在脊髓中表达上调，导致痛觉的中枢敏化［2］。但目前LDH 导致根性疼痛的确切机制并不完全清楚。基质细胞衍生因子1（stromal cell derived factor-1，SDF-1），因最初发现由骨髓基质细胞分泌而得名，它又称趋化因子CXC 配体12（chemokine CXC ligand 12，CXCL12）。趋化因子CXC 受体4（CXCR4）是SDF-1的特异性受体。SDF-1 与CXCR4 广泛地表达于多种细胞和组织中，并在炎症、肿瘤等疾病中起着至关重要的作用［3］。文献报道，在完全弗式佐剂诱导炎性痛模型［4］、癌痛模型［5-6］、术后急性切口痛模型［7］中，阻断SDF-1/CXCR4 信号通路可以减轻模型的痛觉过敏，这提示SDF-1/CXCR4 信号通路参与了多种类型疼痛的发生机制。研究表明，SDF-1/CXCR4 是通过激活细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）通路发挥作用：大鼠足跖切口急性疼痛模型中，SDF-1/CXCR4可激活ERK 通路，但不激活PI3K/AKT 通路［7］；蜜蜂毒注射痛敏预点燃模型中，SDF-1/CXCR4 同时激活ERK 和PI3K/AKT 通路［8］。可见在不同的疼痛模型中，SDF-1/CXCR4 对ERK 和PI3K/AKT 通路的作用是不一样的。目前，在髓核致炎根性疼痛的发病机制中，SDF-1/CXCR4 是否参与，其是否通过激活ERK 和PI3K/AKT 通路发挥作用尚无报道。本研究旨在探讨SDF-1/CXCR4 通路在髓核致炎根性痛大鼠模型中的作用及其机制，为阐明LDH 引起根性疼痛的发病机制提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

SDF-1、GAPDH、Tubulin、GFAP、Neun、CD11b一抗，HRP 标记的IgG 二抗，对照IgG（abcam，美国）；CXCR4、磷酸化ERK（Phospho-ERK，pERK）、磷酸化AKT（Phospho-AKT，pAKT）一抗（Affinity，中国）；FITC 荧光二抗（Invitrogen，美国）；SDF-1 中和抗体（US Biological，美国）；AMD3100、U0126、LY294002（MCE，中国）；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma，美国）；Von Frey 纤维丝（Stoelting，美国）；Biorad ChemiDoc MP 凝胶成像系统（Biorad，美国）；倒置荧光显微镜（Leica，美国）；PE-10导管（Smiths medical，英国）。

1.2 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠（200～280 g）由中山大学动物实验中心提供，许可证号SCXK（粤）2016-0029。分笼饲养，自由进食，室温（23±2）℃，相对湿度55%～65%，维持大鼠12 h/12 h 昼夜节律。本研究所有实验操作均符合中山大学动物实验中心伦理委员会要求并按照实验动物使用原则进行。

1.3 实验分组

本研究分为三个部分。实验一：26 只大鼠随机分为模型组和假手术组。检测每组6 只大鼠手术前后的机械撤足阈值（paw withdrawl threshold，PWT）变化；假手术组术后第14 天和模型组术后第3、7、14 天各3 只大鼠术后脊髓SDF-1、CXCR4、pERK，pAKT 表达变化；模型组2 只大鼠脊髓行免疫荧光化学染色将SDF-1、CXCR4分别与星形胶质细胞标志蛋白GFAP、小胶质细胞标志蛋白CD11b和神经元标志蛋白Neun 共染。实验二：54 只大鼠随机分为假手术组、模型组、溶剂组、AMD3100 组、SDF-1 中和抗体组、对照IgG 组，分别行假手术、建模、建模后连续5 d 鞘内注射50 g/L DMSO 10 uL、CXCR4 抑制剂AMD3100 10 μg、SDF-1 中和抗体5 μg，对照组Ig G 5μg（给药剂量参考文献报道［9-10］和预实验结果）。检测每组6只大鼠手术前后的PWT变化；每组3只大鼠检测脊髓中pERK和pAKT表达变化。实验三：18 只大鼠随机分为溶剂组、U0126组、LY294002 组，分别建模后连续5 d 鞘内注射50 g/L DMSO 10 μL、MEK 的抑制剂U0126 10 μg，PI3K抑制剂LY294002 10 μg（给药剂量参考文献报道［9-11］和预实验结果）。检测每组6 只大鼠手术前后的PWT变化。

1.4 鞘内置管

在实验二和实验三中，在假手术和建模前，参照Liu等［12］描述的方法对大鼠进行鞘内置管。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（50 mg/kg，ip.），切开皮肤暴露L3～4 椎间隙，将PE-10 导管向头侧置入约2 cm 到达腰膨大水平。将导管经皮下隧道固定至大鼠头部两耳之间，关闭切口。术后剔除手术损伤致下肢运动功能障碍的大鼠，并于鞘内注射2%利多卡因10 μL 以验证导管位置，剔除导管位置错误的大鼠。鞘内置管手术后5 d再进行后续实验。

1.5 模型建立

参考文献［13］建立动物模型。用戊巴比妥钠麻醉大鼠（50 mg/kg，ip.），在髂嵴附近做正中纵切口，顿性分离左侧椎旁肌，切除行L5 和L6 关节突关节和L5 椎板，暴露L5 DRG。取尾椎2 个节段自体髓核。模型组将获取的髓核组织覆盖于左侧L5 DRG。假手术组仅行L5 DRG 的暴露，取尾部髓核组织但不将其置于L5 DRG。逐层缝合组织关闭切口。

1.6 PWT的测定

将大鼠放置在箱底为金属网的透明有机玻璃箱中至少15 min，使其充分适应测试环境并处于安静状态。采用Up-Down 方法［14］，用Von Frey 纤维丝（0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51、15.14 g）对大鼠后肢左脚足心部进行机械性刺激，每次刺激持续时间为6～8 s。大鼠在刺激时间内或撤离刺激时出现撤足或舔足现象，则为阳性反应。以2.041g刺激强度为初始刺激强度，若撤足反应为阳性，则选择相邻递减的刺激强度给予刺激；若撤足反应为阴性，则选择相邻递增的刺激强度给予刺激。以第一个转折点的前一点为起点连续6 次的刺激结果。使用计算机程序根据测试计算出PWT。

1.7 Western Blot实验

实验一术后第3、7、14天，每组3只大鼠用于检测蛋白表达。实验二中术后第7天每组3只大鼠检测pERK、pAKT 表达变化。戊巴比妥钠（70 mg/kg，ip.）深麻醉大鼠后断头处死，在冰面上迅速取出大鼠L4-L6节段脊髓。加入蛋白裂解液，匀浆和裂解30 min，裂解后的样品4°C 14 000g离心10 min，取上清液，行BCA 法蛋白定量。配平并变性蛋白。SDS-PAGE 胶电泳分离蛋白后转至PVDF 膜。5%BSA 中封闭1 h，随后加入一抗孵育，4°C 过夜。漂洗后加入相应的二抗室温孵育1h。洗膜后加入ECL 发光液显色曝光。使用Biorad ChemiDoc MP凝胶成像系统进行显色拍照，最后采用Image J 进行条带的灰度分析。

1.8 免疫荧光实验

用2%戊巴比妥（60～80 mg/kg）深度麻醉大鼠后，经主动脉快速灌注200 mL 生理盐水后，继而40 g/L 多聚甲醛灌注固定30 min。将L4～6 脊髓节段取出，40 g/L 多聚甲醛后固定24 h，然后依次用10%、20% 和30% 蔗糖溶液梯度脱水3 d。做连续冠状冰冻切片（20 μm/片），切片漂洗、封闭后加入一抗，4 ℃孵育12 h，漂洗后加入荧光二抗，室温孵育2 h。漂洗、裱片、封片，加入抗荧光淬灭剂后在倒置荧光显微镜下观察摄片。

1.9 统计学分析

统计学分析通过SPSS 20.0（SPSS Inc.，USA）进行，所有数据表示为均数±标准差。PWT 数据应用重复测量的方差分析检验差异。对Western Blot 数据采用单因素方差分析进行检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 髓核自体移植导致大鼠机械痛敏，脊髓中SDF-1、CXCR4、pERK、pAKT表达上调

PWT 测试结果显示（图1A）：经重复测量方差分析，模型组与假手术组间差异有统计学意义（F=54.55，P＜0.001；F=703.9，P＜0.001）；进一步采用Sidak 法作两两比较发现，模型组术后第1、3、7、14、21 天PWT 较术前降低（P均＜0.001），且与假手组比较有统计学差异（P均＜0.001）。Western blot 结果显示（图2A-D）：经单因素方差分析，模型组SDF-1、CXCR4、pERK、pAKT 蛋白表达与假手术组比较有统计学差异（F=15.98，P=0.045；F=26.37，P=0.035；F=82.87，P=0.008；F=65.04，P=0.010），进一步两两比较发现模型组SDF-1、CXCR4、pERK，pAKT蛋白术后比假手术组表达上调（术后第3天P=0.029，P=0.016，P=0.006，P＜0.001；术后第7 天P=0.035，P=0.022，P=0.003，P=0.015；术后第14 天P=0.031，P=0.021，P=0.011，P=0.001）。免疫荧光双染结果显示，SDF-1 主要在神经元分布（图3），而CXCR4 主要在神经元和星形胶质细胞分布（图4）。

2.2 鞘内注射SDF-1 中和性抗体或CXCR4 抑制剂AMD3100 减轻髓核自体移植引起的痛觉过敏，并下调脊髓中pERK、pAKT表达水平

PWT 测试结果显示（图1B）：经重复测量方差分析，各组间差异有统计学意义（F=188.9，P＜0.001；F=76.21，P＜0.001）；进一步采用Sidak法作两两比较发现，模型组、溶剂组和对照Ig G 组PWT 在术后第1、3、5、7 天比假手组降低（P均＜0.001）；AMD3100组和SDF-1中和抗体组的PWT比模型组（第3 天：P＜0.001vs.AMD3100 组或SDF-1 中和抗体组；第5 天：P＜0.001vs.AMD3100 组，P=0.008vs.SDF-1 中和抗体组；第7 天：P＜0.001vs.AMD3100组，P=0.004vs.SDF-1中和抗体组），溶剂组（第3、5天：P均＜0.001vs.AMD3100 组或SDF-1 中和抗体组；第7 天：P＜0.001vs.AMD3100 组，P=0.004vs.SDF-1 中和抗体组）或对照Ig G 组（第3、5、7 天：P均＜0.001vs.AMD3100 组或SDF-1 中和抗体组）提高；与假手术组比较，AMD3100 组和SDF-1 中和抗体组的PWT 仍下降（P均＜0.001）。Western blot 结果显示（图2E，F）：经单因素方差分析，各组间pERK（F=29.91，P＜0.001）和pAKT（F=38.37，P＜0.001）差异有统计学意义；进一步两两比较发现，模型组和溶剂组中pERK 和pAKT 比假手术组表达上调（P均＜0.001）；与模型组或溶剂组比较，AMD3100 组pERK（P=0.001vs.模型组，P=0.003vs.溶剂组）和pAKT（P＜0.001vs.模型组，P=0.001vs.溶剂组）表达下调；与模型组或溶剂组比较，SDF-1中和抗体组的pERK（P=0.002vs.模型组，P=0.005vs.溶剂组）和pAKT（P均＜0.001）表达下调；与假手术组比较，AMD3100 组和SDF-1 中和抗体组的pERK（P=0.048，P=0.029）和pAKT（P=0.014，P=0.040）表达仍上调。

图1 各组大鼠PWT变化情况Fig.1 PWT for rats in different groups

图2 各组大鼠脊髓蛋白表达情况Fig.2 Protein expression in spinal cord of rats in different groups

2.3 鞘内注射MEK 的抑制剂U0126 或PI3K 抑制剂LY294002减轻髓核自体移植引起的痛觉过敏

PWT 测试结果显示（图1C）：经重复测量方差分析，各组间差异有统计学意义（F=88.58，P＜0.001；F=15.7，P＜0.001）；进一步采用Sidak 法作两两比较发现，与溶剂组相比U0126 组和LY294002组PWT 在术后升高（术后第3 天：P=0.04，P=0.001；术后第5 天P=0.009，P=0.04；术后第7 天：P=0.008，P=0.005）。

3 讨论

SDF-1/CXCR4 通路被证明参与多种类型疼痛的形成和发展。有研究结果显示，大鼠单次足底或鞘内注射SDF-1 后可出现持续的痛觉过敏，给予CXCR4 的siRNA 或AMD 3100 可减轻痛敏［15］；在神经病理性疼痛的模型如坐骨神经分支选择切断大鼠模型或坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠模型中，其DRG 及脊髓中SDF-1 和CXCR4 的表达均发生上调，在鞘内注射SDF-1 中和抗体或AMD3100 可减轻模型的痛敏［16-17］；另外，在完全弗式佐剂诱导炎性痛模型［4］、癌痛模型［5-6］、术后急性切口痛模型［7］、再缺血再灌注疼痛模型［18］，化疗药引起的疼痛［10-19］等模型中，均有报道显示SDF-1/CXCR4 参与了痛敏的形成和发展。但目前文献中尚无SDF-1/CXCR4在髓核致炎根性疼痛模型中作用的相关报道。在本研究中，鞘内给予SDF-1 中和抗体或CXCR4抑制剂AMD3100 阻断SDF-1/CXC4 信号通路可减轻髓核自体移植引起的痛觉过敏，说明在髓核致炎根性疼痛的发生发展过程中，SDF-1/CXCR4 也参与其中。

图3 SDF-1与星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元双染结果Fig.3 Co-localization of SDF-1 and astrocyte，microglia or neuron in the spinal cord

图4 CXCR4与星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元双染结果Fig.4 Co-localization of CXCR4 and astrocyte，microglia or neuron in the spinal cord

神经元和胶质细胞之间的相互作用参与了疼痛的中枢敏化机制［20-21］。在本研究中，免疫荧光双染显示SDF-1 主要分布在神经元，而CXCR4 主要分布在神经元和星形胶质细胞。这与Liu等［15］报道的在脊神经结扎神经病理性疼痛模型中的研究结果一致。这提示，在髓核致炎根性痛大鼠模型中，神经元分泌的SDF-1 可能作用于自身或胶质细胞的CXCR4，从而参与疼痛的形成和发展。

有文献报道，SDF-1/CXCR4 通过其下游的ERT 和PI3K/AKT 通路发挥其生物学作用。在不同的疼痛模型中，SDF-1/CXCR4 激活的下游通路有所差异。大鼠足跖切口急性疼痛模型中，预先鞘内注射CXCR4 拮抗剂AMD3100 可以抑制ERK1/2 的激活，却不能抑制AKT 的激活［7］；脊神经结扎神经病理性疼痛模型和BV 注射痛敏预点燃模型中，ERK 和PI3K/AKT 通路则均被激活［8］。本研究证明，在髓核自体移植根性疼痛模型中，SDF-1/CXCR4同时激活了ERK和PI3K/AKT通路而介导痛觉过敏的产生。

细胞信号通路中，存在着广泛的环形反馈环路和交互作用。体外实验中，给予LY294002 或GDC0941（PI3K 抑制剂）可以抑制ERK 的激活；而给予PD98059（MEK 抑制剂），可以抑制AKT 激活［22-23］；AKT 也可以在B-Raf 水平上调节Raf/MEK/ERK通路［24］。即抑制ERK或PI3K/ATK其中一条通路，另外一条通路也可被抑制。这说明ERK和PI3K/AKT 通路间存在交互作用。然而，在本研究的实验二中，并未检测U0126 组和LY294002 组中脊髓pERK 和pAKT 的表达情况，因此并不能显示在髓核致炎根性疼痛大鼠模型中ERK 和PI3K/AKT通路之间相互作用的情况，它们之间的关系有待进一步的研究探讨。

综上所述，本研究证明髓核致炎根性疼痛的大鼠模型中，SDF-1/CXCR4 通过激活ERK 和PI3K/AKT 通路介导疼痛的发生与发展。这为阐明LDH导致根性疼痛的发生机制提供了新的证据。