血浆外泌体miRNAs与妊娠期糖尿病的关系

叶志鑫，陈渡波，陈培松，林穗雯，黄晓晴，李诗琪，刘 斌

（1.中山大学附属第一医院妇产科，广东广州 510080；2.中山大学附属第一医院检验科，广东广州 510080）

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是妊娠期间首次发生或者确诊的糖耐量异常状态，发病率逐年增高［1］，对孕产妇和子代造成各种近期和远期不良影响［2］。早期筛查和及时干预对改善GDM 母儿结局有重要意义［3-5］。外泌体（exosomes）可以携带微RNA（microRNA，miRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、蛋白质等作用于受体细胞［6］，在细胞间信号传递中发挥作用［7］，具有成为疾病诊断和早期预测生物标记物的可能［8-9］。既往研究发现，在不同妊娠阶段，GDM 与正常糖耐量（normal glucose tolerance，NGT）孕妇循环中外泌体的水平和生物活性均存在差异［10］，但是外泌体内miRNAs 的表达变化及与GDM发病机制间的关系尚未完全阐明。本研究拟采用生物信息学分析的方法寻找与糖尿病相关的miRNAs，探讨其在GDM 患者血浆外泌体中的表达水平，进而揭示外泌体miRNAs与GDM 发生发展的关系并探讨其早期预测价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究纳入2019 年1 月至2020 年3 月于中山大学附属第一医院产检，且孕龄在10～16 周的单胎孕妇。采集入组时的外周血，分离血浆后冻存于-80 ℃冰箱备用。排除标准为：①孕前患1 型或2 型糖尿病；②双胎妊娠孕妇。入组孕妇随访至孕24～28 周，根据口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance tests，OGTT）结果，分为GDM 组和NGT 组。GDM 的诊断按IADPSG 标准，即孕妇在妊娠24～28周，空腹8 h 或以上行75 g OGTT，空腹及服糖后1、2 h的血糖值分别为5.1、10.0、8.5 mmol/L，任何一点血糖值达到或超过上述标准即诊断为GDM。本研究经中山大学附属第一医院伦理委员会审批（伦审［2017］253号），入组患者均签署知情同意书。

1.2 数据获取及表达分析

以“microRNA”、“miRNA”、“diabetes”和“Homo sapiens”为检索词从GEO 数据库中（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）检索糖尿病相关的芯片数据集。采用GEO2R 在线工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）分析各个数据集的差异表达miRNAs，以差异倍数＞1.3 或＜-1.3，P＜0.05 为筛选条件确定差异表达miRNAs。对数据集中获得的差异表达miRNAs 分别绘制火山图，并运用Venn Diagramm 对各个数据集筛选得到的上调和下调的miRNAs 分别取交集，获得表达一致的上调或下调miRNAs。

1.3 血浆外泌体的分离、鉴定和miRNAs提取

用超速离心法和外泌体提取试剂盒ExoQuick plasma prep and exosome precipitation kit（EXOQ5 TM-1，System bioscience，USA）从血浆中分离外泌体。超速离心法中，血浆样本在4 ℃条件下离心2 000×g，30 min；12 000×g，45 min；110 000×g，2 h；110 000×g，2 h 获得外泌体。采用透射电镜（JEM-1400，JEOL Ltd.，Japan）观察外泌体的形态结构。采用蛋白质免疫印迹检测外泌体特异性标志蛋白TSG101（ab125011，Abcam，UK）和CD63（25682-1-AP，Proteintech，USA）。采用Nanosight NS300（Malvern Instruments，UK）对外泌体进行纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）。

用miRNeasy Mini Kit（No.217004，QIAGEN，Germany）提取外泌体miRNA。在miRNA 提取过程中加入秀丽隐杆线虫cel-miR-39-3p（Ribobio，China）作为外参。使用Mir-X TM miRNA First-Strand Synthesis Kit（No.638313，Takara，Japan）将miRNA 逆转录成cDNA，用TB Green TM Premix Ex Taq TM Ⅱ（Tli RNaseH plus）（No.RR820A，Takara，Japan）进行实时定量RT-PCR 反应。miRNA 的相对表达量用2-ΔΔCt方法进行计算。

1.4 miRNAs靶基因预测及功能富集分析

用miRDB、Tarbase 8.0 和TargetScan 7.2 三个数据库预测miRNAs 的靶基因，任意两个数据库能同时预测到的靶基因用Cytoscape 软件进行可视化。以Homo sapiens 为背景，对预测得到的miRNAs 靶基因进行京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富集分析。

1.5 统计学方法

采用R 3.6.0 进行统计学分析。定量资料若服从正态分布则采用均数±标准差进行描述，采用两独立样本t检验进行两组间均数比较。采用Pearson 相关分析miRNAs 表达与血糖血脂水平的相关关系。定性资料采用频率进行描述，采用χ2检验进行独立的两组二分类变量的比较。采用logistic 回归模型和受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线检验差异表达miRNAs 对GDM的早期预测效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象基线资料

研究纳入GDM 组30例和NGT组30例孕妇，两组孕妇年龄、入组时及OGTT 时的孕龄、体质量及BMI 等基线资料的差异无统计学意义。GDM 组OGTT 空腹、服糖后1、2 h 血糖值和HbA1c 均明显高于NGT 组。两组新生儿性别及体质量的差异无统计学意义（表1）。

2.2 数据集及差异表达miRNAs的筛选

从GEO 数据库中检索并下载了与糖尿病相关的 5 个芯片数据集 GSE94649、GSE21321、GSE98043、GSE148961、GSE27645。GSE94649 芯片数据集包括6 例1 型糖尿病和6 例正常对照的血清标本；GSE21321芯片数据集中包含9例2型糖尿病和10 例正常对照的血浆标本；GSE98043 芯片数据集中包含2例妊娠期糖尿病和2例正常妊娠孕妇的血浆标本；GSE148961芯片数据集包含18例2型糖尿病和12 例对照的血清标本；GSE27645 芯片数据集包含12 例2 型糖尿病和8 例对照的外周血标本。

经过筛选，GSE94649 中分析得到的差异表达miRNAs 中上调的有48 个，下调的有18 个；GSE21321 中上调的有11 个，未得到下调的miRNA；GSE98043 中上调的有130 个，下调的有227个；GSE148961 中上调的有82 个，下调的有4 个；GSE27645 中下调的有74 个，未得到上调的miRNA。各个数据集的差异表达miRNAs 的分布情况见火山图（图1A）。

通过Venn Diagram 将各个数据集的差异表达上调或下调的miRNAs 分别取交集，在两个数据集中表达一致的miRNAs共10个（图1B）。

2.3 外泌体的鉴定及miRNAs表达

分离得到GDM 组和NGT组患者入组时的血浆外泌体，透射电镜下可观察到外泌体呈中间略微凹陷的盘状结构（图2A）。蛋白质免疫印迹结果显示外泌体特异性标志蛋白TSG101和CD63呈阳性（图2B）。外泌体粒径集中在100～200 nm 间，平均粒径大小为145.9 nm（图2C）。

随后，在两组患者血浆外泌体中对上述分析得到的10 个可能与糖尿病有关的差异表达miRNAs进行检测。实时定量RT-PCR 中用到的miRNAs引物见表2。由于芯片数据集分析结果中没有对hsa-miR-520e-3p/5p 以及hsa-let-7c-3p/5p 进行区分，因此我们对hsa-miR-520e-3p、hsa-miR-520e-5p 以及hsa-let-7c-3p、hsa-let-7c-5p 同时进行了检测。结果显示，GDM 组孕妇血浆外泌体中hsamiR-188-5p（2.08±1.30vs.1.15±0.63，t=3.497，P＜0.001）、hsa-miR-663a（2.17±1.14vs.1.16±0.80，t=3.956，P＜0.001）和hsa-miR-135a-5p（1.89±1.81vs.1.14±0.62，t=2.147，P=0.036）的表达高于NGT组，与芯片数据集分析结果一致。在芯片数据集分析结果中hsa-miR-4707-5p 在1 型糖尿病和妊娠期糖尿病中表达下调，但我们的研究结果表明hsamiR-4707-5p 在妊娠早期GDM 患者血浆外泌体中的表达高于NGT 组（1.57±0.65vs.1.04±0.35，t=3.909，P＜0.001；图3）。我们的结果显示两组孕妇在妊娠早期血浆外泌体中hsa-miR-320c、hsamiR-320d、hsa-miR-520e-3p 和hsa-miR-3135b 的表达差异没有统计学意义（图3）。此外，我们未在妊娠早期孕妇血浆外泌体中检测到hsa-miR-1245b-3p、hsa-miR-520e-5p、hsa-let-7c-3p 和hsa-let-7c-5p的表达。

表1 研究对象基线资料.Table 1 Basal characteristics between GDM and NGT［（），n（%）］

表1 研究对象基线资料.Table 1 Basal characteristics between GDM and NGT［（），n（%）］

1）t test，test statistics is t；2）χ2 test，test statistics is χ2.GDM：gestational diabetes mellitus；NGT：normal glucose tolerance；OGTT：oral glucose tolerance test；BMI：body mass index；HbA1c：hemoglobin A1c.

2.4 miRNAs靶基因预测及功能富集分析

验证结果表明，与正常孕妇相比，随后发展为GDM 的孕妇在妊娠早期血浆外泌体中hsa-miR-188-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-135a-5p 和hsamiR-4707-5p 的表达上调。采用miRDB、Tarbase 8.0 和TargetScan 7.2 三个数据库预测这4 个miRNAs 的靶基因，任意两个数据库能同时预测到的靶基因纳入后续分析，预测结果显示hsa-miR-188-5p 有122 个潜在的靶基因，hsa-miR-663a 有3 个潜在的靶基因，hsa-miR-135a-5p 有507 个潜在的靶基因，hsa-miR-4707-5p 有55 个潜在的靶基因（图4A）。对上述4 个miRNAs 的687 个靶基因进行KEGG 信号通路富集分析，选择了校正后P＜0.01的富集结果，包括14 条信号通路（表3），其中涉及的靶基因共102 个（图4B）。结果显示，miRNAs 的靶基因与胰岛素信号通路等通路有关，其中miR-135a-5p 的靶基因IRS2、PIK3R2、AKT3等为胰岛素信号通路中的关键因子（表4）。因此miR-135a-5p可能通过调控胰岛素信号通路在GDM 的发展中发挥重要作用（图5）。

图1 差异表达miRNAs火山图和韦恩图Fig.1 Volcano maps of differentiate expression miRNAs and Venn diagrams of microarray data

图2 血浆外泌体的特征Fig.2 Characteristics of plasma exosomes

表2 miRNA实时定量RT-PCR引物Table 2 Primer sequence for RT-PCR

2.5 外泌体miRNAs水平与血糖血脂的相关性

以外泌体miRNAs 表达情况与入组时和OGTT时的血糖血脂水平进行相关性分析。结果显示miR-188-5p 和miR-663a 分别与入组时的甘油三酯水平呈正相关关系（P＜0.05），miR-188-5p、miR-663a和miR-4707-5p分别与OGTT各时间点的血糖水平和HbAc1呈正相关关系（P＜0.05；表5，图6）。

图3 孕妇早期血浆外泌体miRNAs表达水平的比较Fig.3 Relative levels of plasma exosome miRNAs in early pregnant women

图4 miRNAs的靶基因预测及KEGG富集分析Fig.4 Target gene prediction and KEGG enrichment analysis of miRNAs

2.6 外泌体miRNA对GDM的早期预测效能研究

为评估血浆外泌体miRNA 对GDM 的早期预测效能，我们进行了ROC曲线分析，结果显示，hsamiR-188-5p 对应的曲线下面积（the area under the ROC curve，AUC）为0.723（95%CI，0.593～0.854；P=0.003），hsa-miR-663a 对应的AUC 为0.790（95%CI，0.664～0.918；P＜0.001），hsa-miR-135a-5p 对应的AUC 为0.656（95%CI，0.514～0.796；P=0.038），hsa-miR-4707-5p 对应的AUC 为0.727（95%CI，0.581～0.875；P=0.002）。采用logistic 回归方程构建基于hsa-miR-188-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-135a-5p和hsa-miR-4707-5p的联合预测模型，ROC 曲线分析结果显示，4 个miRNAs 联合分析对应的AUC 为0.839（95%CI，0.724～0.954；P＜0.001；图7），其灵敏度为0.833，特异性为0.833。

表3 KEGG 富集分析结果Table 3 Results of KEGG analysis.

表4 参与胰岛素信号通路的miRNAs靶基因Table 4 Target genes of miRNAs participating in insulin signaling pathways

3 讨论

图5 胰岛素信号通路中miR-135a-5p的靶基因Fig.5 The target genes of miR-135a-5p in insulin signaling pathway

表5 外泌体miRNAs水平与血糖血脂的相关性分析Table 5 The Correlation between exosomal miRNAs and blood glucose and lipid

图6 外泌体miRNA水平与临床指标的散点图Fig.6 Scatter plots of exosomal miRNA levels and clinical indicators

图7 ROC曲线分析miRNAs表达水平对妊娠期糖尿病的预测效能Fig.7 The predicted performance of miRNAs expression evaluated with ROC analysis

本研究旨在寻找早期预测妊娠期糖尿病的潜在生物标记物并探讨其与妊娠期糖尿病发病的关系。我们基于生物信息学分析方法找到10 个可能与糖尿病相关的miRNAs 并在孕妇早期血浆外泌体中进行了检测，研究发现随后发展为GDM 的孕妇在早期血浆外泌体中hsa-miR-188-5p、hsamiR-663a、hsa-miR-135a-5p 和hsa-miR-4707-5p的表达高于正常妊娠女性，以logistic 回归方程构建基于miR-188-5p、miR-663a、miR-135a-5p 和miR-4707-5p的联合预测模型，ROC 曲线分析结果显示AUC 为0.839，具有较好的预测效能。KEGG通路富集分析结果显示miR-135a-5p 可能通过调控胰岛素信号通路影响GDM的发生发展。

外泌体是具有双层膜结构的囊泡状小体，妊娠第6 周即可在孕妇外周血中发现胎盘来源的外泌体［11］。Gillet 等发现，GDM 孕妇早期血清细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）中miR-132-3p、miR-1323 等10 个miRNAs 水平显著高于NGT 孕妇，差异miRNAs 的靶基因参与滋养细胞的增殖/分化、胰岛素分泌调节和葡萄糖代谢［12］。然而，该研究仅纳入既往报道的与GDM 或胎盘功能异常相关的17个miRNAs。本研究通过数据检索，纳入1 型糖尿病、2 型糖尿病和GDM 患者血浆miRNAs 研究的芯片数据集，筛选在两个或以上数据集中表达一致的差异miRNAs 并采用孕妇血浆外泌体进行验证，纳入miRNAs 数据较为全面，有利于发现新的早期预测因子。

我们发现的差异miRNAs 可能通过调控胰岛素信号通路影响GDM 发生发展。研究表明miR-135a 在糖尿病患者骨骼肌［13］和糖尿病肾病［14］中表达上调。骨骼肌中miR-135a 通过靶向抑制IRS2使胰岛素信号通路下调，并且在db/db小鼠模型中，miR-135a 敲低能增加骨骼肌IRS2 和p-AKT 水平，改善糖代谢［13］。糖尿病肾病中高表达的miR-135a-5p 靶向sirt1 参与SMAD3 信号通路从而改善TGFβ1 介导的肾纤维化［14］。此外，miR-135a-5p 可以通过靶向Apc 激活Wnt/b-catenin 信号，抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化和成脂［15］。

既往研究表明，高脂饮食诱导的GDM 小鼠模型中，miR-188-5p 的表达显著高于正常小鼠［16］。此外，miR-188-5p 在糖尿病肾病尿液外泌体中表达显著升高［17］。miR-663 在早发性子痫前期胎盘中表达上调，进而在HTR-8/SVneo滋养层细胞中发现miR-663 可抑制肾脏肾素原mRNA 和蛋白的表达［18］。我们的研究发现，miR-4707-5p 在GDM 孕妇血浆外泌体中高表达，与既往芯片数据集分析结果不一致。主要原因是研究人群、检测标本和检测方法的不同，而miR-4707-5p与糖代谢异常的关系尚不清楚。

我们的研究中hsa-miR-320c、hsa-miR-320d、hsa-miR-520e 和hsa-let-7c 在血浆外泌体中无法检出，或在GDM 和NGT 两组表达差异无统计学意义。既往研究表明，这些miRNAs 与糖尿病的关系存在一定争议。Liu 等研究表明1 型糖尿病患者中miR-320c 表达升高且与β 细胞损伤有关［19］，但Ding 等［20］发现，2 型糖尿病患者血清中miR-320c、miR-320d表达下调。Capobianco等［21］指出，肥胖患者内脏脂肪组织中miR-520e 下调，与脂肪对葡萄糖的摄取有关。let-7 与糖尿病的关系尚有争议。Garavelli 等［22］研究发现，let-7c 在1 型糖尿病中表达上调，但Brennan 等［23］的研究发现let-7 在糖尿病患者颈动脉斑块和糖尿病ApoE-/-小鼠中降低。hsa-miR-3135b、hsa-miR-1245b-3p 与糖尿病的关系尚不明确。

本研究发现10-16 周孕妇血浆外泌体miRNAs与妊娠期糖脂代谢水平相关。但本研究未对孕前、孕晚期和产后的血浆外泌体进行检测，无法明确相关的外泌体miRNAs 在围产期的动态变化情况。母体血浆外泌体hsa-miR-188-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-135a-5p 和hsa-miR-4707-5p 对GDM 具有一定的早期预测价值，进一步研究可进行大样本、多中心临床研究，以明确miRNAs 的阳性、阴性预测值、敏感度和特异度并且建立标准化的外泌体分离、保存方法以满足其作为GDM 早期筛查标志物的要求。

综上所述，妊娠早期GDM 孕妇血浆外泌体内表达上调的hsa-miR-188-5p、hsa-miR-663a、hsamiR-135a-5p 和hsa-miR-4707-5p 具备成为GDM早期预测潜在生物标志物的可能。其中，miR-135a-5p 可能通过抑制胰岛素信号通路中的分子等途径与GDM的发生相关。