TLR4和MyD88在食管鳞癌组织中的表达及临床意义

梁旭阳，徐 萍，吕胜祥，张志梅，王 璐，张树贤，任 玲，马艳芹

（1.南京医科大学连云港临床学院//连云港市第一人民医院消化内科，江苏连云港 222061；2.南京医科大学上海松江临床医学院消化内科，上海 201600）

作为一种世界上每年新增死亡人数排在第七位的恶性肿瘤［1］，食管癌最常见的病理类型是鳞状细胞癌，且其早期诊断困难，预后较差。目前，国内外对食管癌发生、发展的病理生理机制尚未完全阐明，因此，深入了解食管癌的发生、发展、侵袭和转移的病理生理机制，为食管癌早诊、早治寻找有效措施，对降低食管癌患者的病死率、延长其生存时间及提高其生活质量具有重要临床意义。具有多种调节功能的Toll 样受体（TLR）/髓样分化因子88（MyD88）信号传导通路，在免疫反应、炎症反应及肿瘤的发生、发展过程中均发挥了重要作用［2］。MyD88 是TLR 信号通路中关键的中转蛋白，通过其承前启后地传导信号作用，刺激了下游促炎症因子和和抗凋亡因子的表达，最终激活了免疫系统的先天免疫应答反应，进而影响了肿瘤患者临床发展与预后［3-5］。感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等均与MyD88 有较为明确的关系，且MyD88 被认为是干预治疗这些疾病的重要靶点。作为DNA 多聚酶辅助蛋白的增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclea rantigen，PCNA），存在于细胞核中，在DNA的合成中起重要作用。作为判定细胞增殖活性的内源性标记物，PCNA 反映了肿瘤的恶性倾向。有研究显示抑制TLR4 的表达，可以抑制癌细胞的PCNA 表达，进而抑制肿瘤细胞的增殖［6］。作为血管内皮细胞增生的刺激因子，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种可以直接激活血管生成，并使血管通透性增加的蛋白质。有研究发现TLR4 可以通过调节VEGF 的表达水平而影响肿瘤血管的生成，但是其具体机制尚不清楚［7］。故本研究应用免疫组化法检测TLR4、MyD88及PCNA 与VEGF在食管鳞癌组织中的蛋白表达水平，分析探讨MyD88 与TLR4 及其PCNA、VEGF 的相互关系及与食管鳞癌患者临床生物学特性的关系。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 临床资料 收集我院病理样本库中，2011年01 月至2014 年09 月的食管鳞状细胞癌患者临床数据及所有石蜡标本72 例，其中癌组织为A 组，对照组B 组为正常组织（经病理证实无鳞癌细胞的癌组织缘外6 cm 组织）。72 例患者在行食管癌根治术前均未行放射和化学治疗，且均由具有高级职称的病理医师确诊为食管鳞癌。所有患者年龄均在43～74 岁之间，平均年龄为62 岁，其中有62 例男性，10 例女性；患者鳞癌组织分化情况：14 例高分化，48 例高中及中分化，10 例中低及低分化鳞癌；患者癌组织浸润深度情况：12 例局限在黏膜及黏膜下层，14 例浸润至固有肌层，46 例浸润至外膜及邻近结构；患者淋巴结转移情况：26 例伴有淋巴结转移，46例无淋巴结转移。临床分期（以2009年国际抗癌联盟（UICC）和美国癌症联合委员会（AJCC）制订的食管癌TNM 分期标准第7 版为依据）情况：其中有8例患者属于临床分期Ⅰ期，21例属于临床Ⅱa期，24例属于临床Ⅱb期，11例属于Ⅲa 期、3 例属于Ⅲb 期、4 例属于Ⅲc 期、只有1 例属于Ⅳ期。本研究为回顾性研究，研究开始前已通过伦理委员会审批。

1.1.2 主要试剂 我们的MyD88 多克隆抗体、PCNA 单克隆抗体、VEGF 单克隆抗均属于兔抗人抗体，且均购于美国Abcam 公司；EnVision 免疫组化试剂盒购于北京中杉生物技术有限公司。

1.2 方法

文章采用免疫组化EnVision 二步法。首先制作连续石蜡切片，其厚度为4 μm；在温度设置为70 ℃的恒温烤箱中加热3 min；在二甲苯和梯度酒精中进行脱蜡与水化，然后在高压锅中应用柠檬酸缓冲修复液进行抗原热修复（修复液浓度0.01 mol/L、pH6.0），冷却至室温；应用浓度为3%的H2O2孵育，10 min 后应用PBS 洗涤，再滴加一抗（一抗稀释比：TLR4 为1：200、MyD88 为1：300、PCNA 为1：200、VEGF为1：200）；在4 ℃恒温环境下过夜后，再滴加二抗；室温孵育15 min 后，滴加DAB 溶液进行显色，用苏木素进行复染；最后进行分化，脱水，透明，中性树胶封片等操作。阳性对照为已知阳性癌组织切片，阴性对照中用PBS溶液代替一抗即可。

1.3 结果判定

所有染色后的组织切片，在双盲条件下，由我院两位病理科医生进行判读。根据食管鳞状细胞，在高倍显微镜下随机选择不少于1000 个定位明确（TLR4蛋白定位于细胞膜和细胞质、MyD88定位于细胞浆、PCNA 定位于细胞核、VEGF 定位于细胞浆）出现淡黄色至棕褐色颗粒的的鳞癌细胞，按照染色强度及阳性细胞所占百分比进行评分。具体评分标准为：无色计为0 分，淡黄色计为1 分，棕黄色计为2 分，棕褐色计为3 分；阳性细胞百分比≤10.0%计为0 分，11.0%～25.0%计为1 分，26.0%～50.0%计为2 分，51.0%～75.0%计为3 分，≥76.0%计为4 分。总积分为上述两项评分的和，阳性表达定义为总积分≥5分。

1.4 统计学分析

统计学分析软件为SPSS 19.0 版本，采用百分比表示计数资料，应用卡方检验或Fisher′s 确切概率法来进行组间比较；TLR4、MyD88、PCNA、VEGF在食管鳞癌组织中的蛋白表达情况与临床病理参数关系的分析，采用逐步Logistic 回归分析，相关性采用Spearman 等级相关分析。以α=0.05 作为检验水准。

2 结果

2.1 食管鳞癌组织中TLR4、MyD88、PCNA 及VEGF的蛋白表达情况

我们的之前研究［8］显示TLR4 蛋白表达主要定位在食管鳞癌细胞浆和（或）细胞膜中，而细胞核中几乎不表达，阳性细胞主要呈棕黄色至棕褐色，癌旁正常组织中较少见染色阳性细胞，提示在食管鳞状细胞癌组织中TLR4 蛋白呈高平表达（图1AB）。统计分析显示在食管鳞癌和癌旁正常组织中，TLR4 蛋白的阳性表达率分别为66.7% vs 29.17%，差异有统计学意义（P=0.031）。

图1 TLR4在食管鳞癌组织和癌旁组织中的蛋白表达Fig.1 Protein expression of TLR4 in esophageal squamous cell carcinoma and paracancerous normal tissues

MyD88 蛋白表达主要定位于食管鳞癌细胞的胞浆中，阳性细胞呈淡黄色至棕黄色，癌旁正常组织中较少见染色阳性细胞，说明食管鳞癌细胞中MyD88蛋白呈过度表达（图2A-B）。统计分析显示，MyD88 蛋白表达在食管鳞癌和癌旁正常组织中的阳性表达率分别为69.44%vs22.22%，差异有统计学意义（P=0.011）。

图2 MyD88在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达Fig.2 Protein expression of MyD88 in esophageal squamous cell carcinoma and paracancerous normal tissues

PCNA 蛋白表达定位于食管鳞癌细胞核中，阳性细胞呈棕黄色至棕褐色，较少阳性染色细胞出现在癌旁正常组织中，说明食管鳞癌细胞中PCNA 蛋白呈高表达（图3A、B）。本研究显示食管鳞癌和癌旁正常组织中，PCNA 蛋白表达的阳性率分别为43.06%vs6.94%，且差异有统计学意义（P=0.012）。

图3 PCNA在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达Fig.3 Protein expression of PCNA in esophageal squamous cell carcinoma and paracancerous normal tissues

VEGF 蛋白表达定位于食管鳞癌细胞浆中，阳性细胞呈现棕黄色至棕褐色，较少阳性染色细胞出现于癌旁正常组织，说明食管鳞癌细胞中VEGF 蛋白亦有过度表达（图4A、B）。本研究显示在食管鳞癌和癌旁正常组织中，PCNA 蛋白表达的阳性表达分别率为61.11%vs16.67%，差异有统计学意义（P=0.022）。

图4 VEGF在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达Fig.4 Protein expression of VEGF in esophageal squamous cell carcinoma and paracancerous normal tissues

2.2 食管鳞癌TLR4、MyD88、PCNA、VEGF 蛋白表达水平和临床病理因素的关系

我们应用逐步Logistic 回归分析方法分析该72例食管鳞癌组织中TLR4、MyD88、PCNA、VEGF 的蛋白表达水平与临床生物学因素的关系，得出：食管鳞癌组织中TLR4的蛋白表达与淋巴结转移和临床分期呈正相关（P=0.005；P=0.032），差异有统计学意义，与年龄、性别、癌组织分化程度及浸润深度不相关；MyD88 蛋白表达水平随着临床TNM 分期的增加而逐渐升高，差异有统计学意义（P=0.005），亦与年龄、性别、癌组织分化程度及浸润深度不相关（P＞0.05）。同样可见，PCNA的蛋白在食管鳞癌组织中的表达与临床TNM 分期呈正相关（P=0.000），与患者年龄、性别、癌组织分化程度及浸润深度无关（P＞0.05）。食管鳞癌组织中VEGF的蛋白表达与年龄、性别、分化程度及浸润深度亦无关（P＞0.05），但随着临床TNM 分期的增加而逐渐升高（P=0.003；表1）。

2.3 食管鳞癌组织中MyD88 与TLR4 及PCNA、VEGF阳性表达的相关性分析

我们的研究表明TLR4在食管鳞癌组织中呈高表达［8］。本次研究在食管鳞癌中将TLR4 和MyD88的表达情况共同分析得出：72 例食管鳞癌组织中，TLR4的蛋白表达阳性率为66.67%（48/72），MyD88为69.44%（50/72），两者蛋白表达同时表达阳性与阴性的比率分别为59.72%和23.61%。经过统计学分析发现，食管鳞癌组织中TLR4 和MyD88 的蛋白表达呈正相关，且其相关性有显著统计学意义（r=0.618，P＜0.01）。

本次研究显示，在食管鳞癌组织中PCNA 蛋白表达的阳性率是43.06%（31/72），MyD88 和PCNA同时表达阳性和阴性的比率分别为41.67%和29.17%。统计学分析显示，食管鳞癌组织中MyD88 和PCNA 的蛋白表达亦呈正相关，且相关性有统计学意义（r=0.516，P＜0.01）。在食管鳞癌组织中VEGF 蛋白表达的阳性率为61.11%（44/72），MyD88 和VEGF 蛋白同时表达阳性和阴性的比率分别为58.33%和27.78%。通过分析发现，食管鳞癌组织中MyD88 和VEGF蛋白表达有正相关性，且其相关性有统计学意义（r=0.708，P＜0.01）。

3 讨论

近年的许多研究资料表明，恶性肿瘤的发生、发展与慢性炎症之间存在密不可分的关系。在持续反复的慢性炎症刺激下，恶性肿瘤的发生率可增加，同时炎症相关的调节因子与恶性肿瘤的转移密切相关［9］。

Toll 样受体是1 型跨膜蛋白，主要存在于免疫细胞中，包括树突状细胞和巨噬细胞，可检测侵袭性致病微生物［10］。通过激活免疫细胞，TLR 能够产生内源性或外源性免疫反应。TLR4是TLR 的一个子类型，先前的研究显示TLR4 在各种恶性肿瘤中均有表达，包括胃癌、肝细胞癌、前列腺癌和淋巴瘤，特别是TLR4的Asp299Gly基因多态性与肿瘤的发生和发展密切相关［11］。我们之前的研究发现，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、TLR4在食管癌组织中高表达，并在其发生发展中发挥重要作用［8］。作为TLRs 信号途径中普遍存在的接头分子MyD88，是一种胞浆内蛋白质，一旦接收到肿瘤抗原信息，MyD88 可被TLR4 激活，引起NF-κB 核转位，最终激活基因转录［12］。越来越多的证据表明，MyD88也是免疫抑制和肿瘤发生过程中的关键分子，在多种恶性肿瘤的发生、发展和侵袭、转移中发挥重要作用［13-15］。本研究提示：在食管鳞癌组织中TLR4 和MyD88 蛋白均呈高水平表达，且表达与患者性别、年龄、癌组织浸润深度及分化程度无关，但随着TNM 分期的增加而逐渐升高（P=0.032，P=0.005；表1）。

表1 TLR4、MyD88、PCNA、VEGF蛋白表达与食管鳞癌临床病理因素的Logistic回归分析Table 1 Logistic regression analysis of TLR4，MyD88，PCNA，VEGF protein expression and clinicopathological factors of ESCC

恶性肿瘤的发生是一种复杂的目前还不完全清楚的改变，其涉及多个基因分子的改变。反映肿瘤细胞的增殖活性的增殖细胞核抗原（PCNA），是一种酸性非组胺核蛋白。其仅在增殖细胞中合成与表达，是DNA 复制合成修复过程中的必需物质。PCNA 基因表达在肿瘤细胞增殖活跃及DNA 复制加速时明显增强，与细胞增殖状态明显相关，可作为一项评估细胞增殖状态的指标［16］。Kii 等［17］报道Ⅱ～Ⅲ期食管鳞癌的PCNA 阳性表达率为37%，但未提及PCNA 表达与临床病理因素的相关性。同样，我们的研究显示在食管鳞癌细胞中PCNA 蛋白呈高水平表达，且该表达与TNM 分期呈正相关（P=0.000），但与患者年龄、性别、癌组织浸润深度及分化程度均无关（表1），表明PCNA 蛋白的高表达可能促进了食管鳞癌的发生和发展。

肿瘤细胞对基底膜、细胞外基质及间质结缔组织的侵袭，产生远处转移灶，新生血管形成等，是恶性肿瘤对邻近组织发生侵袭和转移的几个主要的环节。血管生成是肿瘤生长、侵袭及扩散的一个重要先决条件。作为促进内皮细胞迁移、增殖和分化最重要的分子之一，VEGF，其在体外具有促细胞分裂的作用，在体内具有促血管生成的作用。通过降低VEGF 表达，可以抑制肿瘤组织血管生成，诱导肿瘤细胞凋亡，从而起到治疗肿瘤的作用。有研究报道，VEGF 与骨肉瘤、胃癌、卵巢癌和肺癌等实体瘤细胞的生长、转移、组织学分级和预后密切相关［18-22］。已被美国批准用于治疗多种恶性肿瘤的人源化抗VEGF 单克隆抗体（Avastin），能中和VEGF 的生理作用［23］。我们的研究发现，在食管鳞癌组织中VEGF 的蛋白表达水平明显上调，且与患者的临床分期显著相关（P=0.003），但与患者年龄、性别、肿瘤浸润深度及肿瘤分化程度无关，表明VEGF 的蛋白高表达可能促进了食管鳞癌的进展，其促血管生成的作用可能有助于食管癌细胞侵入淋巴管，在淋巴结形成转移灶。

我们的研究得出，在食管鳞癌组织中MyD88和TLR4、PCNA 以及VEGF 的蛋白表达均呈正相关（P＜0.01），产生这种现象的原因可能是TLR4-MyD88 信号通路的激活，激发了PCNA 和VEGF 的表达，但具体机制有待于进一步的研究。本结果表明，TLR4、MyD88 及PCNA、VEGF 在食管鳞癌组织中呈显著高表达，并且具有相关性，提示TLR4 和MyD88 信号传导通路在食管鳞癌发生、发展、浸润及转移等生物学行为中均发挥重要作用。TLR4-MyD88 信号通路有可能作为反映食管癌预后的重要生物学指标及抗食管癌的重要靶点，联合检测二者的表达水平，对食管癌的临床诊断及预后有重要作用，有助于为患者制定个体化临床治疗方案。本研究不足之处在于TLR4-MyD88信号通路调节PCNA、VEGF表达的具体机制有待于进一步研究。