染色体拷贝数变异测序(CNV-seq)对稽留流产绒毛组织的病因学检查分析

张卉 祖淑静 张宁 单飞 杨威

(哈尔滨市红十字中心医院，黑龙江 哈尔滨 150076)

稽留流产又称过期流产，指胚胎或胎儿已死亡滞留宫腔内未及时自然排出者。胚胎或胎儿染色体异常是早期流产最常见的原因，约占50%～60%，染色体异常包括数目异常和结构异常。其中数目异常以三体综合征居多，常见的有13、18、21、16和22-三体，其次为X单体，三倍体和四倍体少见。结构异常引起流产并不常见，主要有平衡易位、倒置、缺失、重叠及嵌合体等[1]。

染色体拷贝数变异测序(copy number varaition sequencing,CNV-seq)是采用高通量测序(next generation seqencing,NGS)技术对样本DNA进行低深度全基因组测序，将测序结果与人类参考基因组碱基序列进行对比，通过生物信息分析发现样本存在的拷贝数变异(CNVs)。具有流程简单、易操作、通量高、兼容性好、所需DNA样本量低等优点，样本可为外周血、羊水、脐血、绒毛组织等[2]。为临床检测染色体疾病提供新的解决手段，可发现染色体非整倍体及染色体微缺失/微重复等。CNV-seq技术可用于产前诊断、流产原因排查、不孕不育原因查找，以及疑似染色体疾病患者的染色体异常检测。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2017年1月至2019年3月在哈尔滨市红十字中心医院妇产科门诊临床诊断的224例稽留流产患者，患者身体健康状况良好，单胎。经产前诊断门诊遗传咨询自愿接受流产病因学检测的患者，进行检测前咨询，告知CNV-seq技术检测目的及意义，行人工流产时留取绒毛组织送检行CNV-seq。年龄在20～42岁，孕龄12周内的患者。

1.2 实验方法

1.2.1 标本的采集对临床明确稽留流产的患者夫妇进行检测前的遗传咨询并签署知情同意书。收集稽留流产患者的绒毛组织(无菌操作，无污染)取50～100g，放入生理盐水中多次漂洗，漂洗至无血液成分，取黄豆粒大小的绒毛组织放入PE管密封管内，及时送检。

1.2.2 将采集到标本送检至北京贝瑞和康生物技术有限公司。

1.3 CNV-seq实验方案及流程图，详见表1、图1.

表1 CNV-seq技术实验方案

图1 CNV-seq实验流程图

1 4 数据分析把检测的DNA序列数据和基因组数据库进行比对，得到样本中每条染色体上可比对的唯一序列含量，根据生物信息学分析，计算出每条染色体的覆盖深度值，并转化为衡量染色体异常风险的指数。样本中某一染色体DNA(chr N)所占总DNA比例可以表示为覆盖深度Cov-chr N。然后对深度进行修正，通过样本染色体的Cov-ratio来判断胎儿染色体拷贝数是否异常，统计检验的值为Cov-ratio值，Cov-chr N以及Cov-ratio值计算如下：覆盖深度Cov-chr N=样本染色体N上唯一序列片段总数/参考序列染色体N上唯一序列片段总数；样本的chr N的Cov-ratio=chrN的修正深度/平均修正深度；样本的Cov-ratio值>1.3判定为样本染色体重复，Cov-ratio值<0.7判定为样本染色体缺失。

2 结果

2.1 CNV-seq结果 224例稽留流产绒毛组织，检测出染色体畸变114例，其中阳性检出率为51%(114/244) ，其中数目异常71例，占31.70%，其中包括特纳综合征20例、16-三体19例、22-三体7例、21-三体6例、13-三体3例、14-三体2例、20-三体1例、18-三体1例、15-三体1例、8-三体1例、4-三体1例、三倍体8例。详见表2。

表2 CNV-seq阳性结果(染色体数目异常)

2.2 CNV-seq结果根据测序及统计每条染色体的唯一序列片段所得出的结果分析，CNV-seq发现染色体畸变阳性率为51%(114/224)，单纯数目异常为31.70%(71/224)，嵌合体为3.12%(7/224)，其它染色体畸变包含微缺失/微重复为16.07%(36/2224)。临床意义不明的拷贝数目变异(Copy number variants of uncertain significance，VUS)，即未确定性质的已报道DNA异常或未见报道的新变异，尚不能确定与其表型意义可能与稽留流产有无关系。详见表3。

表3 CNV-seq阳性结果(染色体畸变除去数目异常以外嵌合体、部分微缺失/微重复)

注：高通量测序DNA测序查询的数据库：DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及PubMed公共数据库资源。

3 讨论

3.1 稽留流产是胚胎停止发育未及时排除体外胚胎停止发育的主要原因之一是胚胎染色体异常，导致染色体异常的原因目前无明确定论，高龄是高危因素，与环境、感染、免疫、不良因素也有相关性。检测胚胎染色体异常的方法有染色体核型分析、荧光原位杂交(FISH)、高通量DNA测序等技术。染色体核型分析常用G显带技术能够检查出绝大多数的染色体的异常情况，包括染色体数目异常如三体型、单体型、多倍体，染色体结构异常如易位、倒位及10Mb以上的片段缺失、重复等。染色体核型分析应用范围广、应用时间较长，检测结果比较受临床医师信赖，是对绒毛、羊水或脐血进行产前诊断的主要方法和金标准。染色体核型分析技术检测流产绒毛组织染色体的研究已经比较深入。在国外，早在1975年就有学者报道了1500例自然流产组织样本之后发现约有60%的绒毛染色体数目异常，主要为非整倍体和多倍体[3]。国内学者们在染色体核型分析技术检测绒毛染色体方面也做了大量研究：欧阳鲁平等[4]利用传统核型分析技术检测了1160例早孕期流产绒毛样本，检测成功1140例，检测成功率为98.2%，检测出62例染色体异常核型，占5.44%，其中数目异常共32例(51.6%)，以45,X最多见，共 15例，其次是13-三体6例，结构异常5例，嵌合体22例。本研究对224例稽留流产绒毛组织进行CNV-seq检测，共检测出71例数目异常，45,X最多见,共20例，16-三体19例，22-三体7例也是导致流产的主要原因，这与孙义锡[5]的研究结果一致。与欧阳鲁平等[4]研究结果相近。CNV-seq比较核型分析技术，对检测标本要求较低，分辨率及检测成功率高，成为快捷、准确、灵活的新型检测手段[6]。随着高通量测序技术的成熟与发展，全基因组测序被应用到各种领域，尤其是遗传性疾病的研究方面备受关注。目前人类已知疾病中，大约有4000多种疾病与基因异常有关[7]。在传统细胞遗传学只能检测5Mb以上的缺失和重复，5Mb以下隐藏着众多的微小不平衡，是细胞遗传学检测难以诊断的。

3.2 FISH与传统染色体核型分析技术 FISH有着快速、高效等特点，但也存在一定的局限性。FISH技术现阶段只能针对已知的染色体非整倍体异常进行检测，根据目前的研究，三体型可发生在除了1号染色体以外所有的染色体，而目前在临床上使用的FISH探针只涉及13、16、18、21、22、X和Y这7条染色体，不能覆盖所有染色体组，这将会漏诊和误诊。临床常用21、18、13、X、Y 五条探针。FISH技术只能检测染色体的数目异常，并不能对染色体结构异常进行检测。也不能检测染色体微小变异，也就是说，FISH检测结果为阴性的样本，并不能说明该样本不存在由易位、倒位、缺失及重复等结构异常所导致的染色体核型异常。据文献报道，有15%～30%的核型异常是FISH不能检测出来的[8]。FISH存在有一定的假阳性率和假阴性率。有文献进行了大样本的研究，分析了29039例样本只有1例假阳性(假阳性率=0.003%)和7例假阴性结果(假阴性率=0.024%)[9]。

3.3 CNV-seq 应用本研究224例检测成功率100%，阳性样本占总样本率51%(114/224)，低于范宝光等[10]研究的64.15%，徐蕾等[11]研究的79.59%。单纯数目异常为31.70%(71/224)，嵌合体为3.12%(7/224)，其他染色体畸变包含微缺失/微重复为16.07%(36/2224)。文献报道[12]流产染色体异常16-三体最多见，其次21-三体和22号三体。Jiandong Shen等[13]采用高通量测序技术检测了 436 例流产绒毛样本，检出异常核型样本 225 例，占 51.6%，包括188 例非整倍体异常，23 例片段微缺失微重复，及 14 例三倍体。1978年顾世光报道，早期稽留流产中 30.5%～54.9%的流产儿具有异常染色体[14]。赵佳[15]等人对 1032 例大样本流产绒毛样本进行检测，检出异常核型445 例，异常率 43.12%。我们研究224例稽留流产患者中特纳综合征20例，16-三体19例，22-三体7例，21-三体6例，也是比较常见，与文献报道基本相符合。其次13-三体3例，14-三体2例，20-三体1例，18-三体1例，15-三体1例，8-三体1例，4-三体1例，三倍体8例。特纳综合征病例大多数在胚胎期流产。本研究检测20%以上的染色体嵌合及染色体微缺失/微重复变异。其他染色体畸变包含微缺失/微重复为16.07%(36/224)。

3.4 CNV-seq的优势与细胞培养核型分析相比其特异性、敏感性在检测染色体数目异常上具有较高的一致性，能够精确分析，利用Hiseq2500测序快速要得到结果，在时间上有较大优势。由于不需要进行细胞培养，减少了细胞培养失败的可能性。相较于染色体核型分析和FISH技术，采用高通量基因测序技术对流产绒毛进行检测有以下几方面的优势。第一，高通量测序又可称为新一代深度测序，是指一次性能并行测序几百万到十亿条DNA分子，可对一个物种的转录组和基因组进行更深入、更全面、更细致的分析[16]。以Solexa技术为例，采用了该技术的Hi Seq 2500 测序仪，一台机器在短短两周的时间内能产出超过300G 的数据，这相当于把人类基因组重复测序100遍以上，短时间内大输出量的测序与以往技术相比较最突出的优势。第二，实验对样本要求较低，即使绒毛样本退化只要DNA含量达到一定的测序要求就能对样本进行检测，这就很大程度上提升了样本的检测成功率。第三，对于染色体结构异常，该技术可检测到100kb以上的染色体片段的微缺失和微重复，提高了染色体异常的检出率。而以往使用染色体核型分析技术只能排查出10Mb以上的染色体结构异常，这就导致很多存在细微结构异常的染色体被漏诊，所以有学者认为，早期自然流产绒毛的染色体异常率实际上应该高于普遍报道的50%[17]。有文献报道，通过大样本量的研究，采用高通量检测技术对智力低下的患者进行遗传学分析，发现这些患者存在染色体结构上的微缺失微重复[18]。

3.5 CNV-seq结果解读分析绒毛组织染色体畸变是否存在，如结果无异常时，可以基本排除稽留流产非遗传物质染色体畸变所致，建议夫妻进行其他检查。流产原因还有精子畸形率、免疫、感染环境等等。如染色体畸变为非整倍体多数是生殖细胞成熟或受精卵早期卵裂过程中，染色体不分离或丢失等原因造成的[19]。稽留流产的病因可能与夫妻年龄、情绪、孕前孕期接触有毒有害物理、化学、药物等不良环境相关。如染色体畸变为缺失/重复，考虑拷贝数变异是新发突变还是来源于亲本(夫妻之一)，夫妻均需行CNV-seq检测。无论是新发突变还是来源亲本再次妊娠均需进行遗传咨询及产前诊断。

总之，应用CNV-seq对稽留流产绒毛组织染色体畸变进行检测能明确稽留流产的病因，有利于临床医师快速准确寻找稽留流产病因，对再次妊娠有重要的指导意义。