无创产前基因检测在胎儿性染色体疾病筛查中的应用

姚润斯 马容 揭深秋 赵卫华

(深圳市第二人民医院 产前诊断中心，广东 深圳 518035)

1997年，卢煜明[1]教授首次发现孕妇外周血中存在游离胎儿DNA，随后各研究机构开始竞相开发相关技术，以鉴定、定量和测序妊娠期孕妇外周血中的游离胎儿DNA，从而筛查染色体非整倍体异常和其他遗传疾病。2011年10月，无创产前基因检测(non-invasive prenatal genetic testing，NIPT)首次用于21-三体综合征的商业化检测，后来发展到筛查18-三体、13-三体综合征以及胎儿性别的鉴定等。最近一项针对37个研究进行的游离胎儿DNA非整倍体筛查的meta分析发现，NIPT对21-三体、18-三体和13-三体的汇总加权检测率分别为99.2%、96.3%和91.0%[2]，可见NIPT对21-三体、18-三体和13-三体的检测有很高的准确性。

目前有研究表明，NIPT不仅可以检测常染色体疾病，其对性染色体非整倍体的检测也有较高的准确性[3]。值得注意的是，性染色体非整倍体的发生和孕妇年龄无关，发生率在人群中为1/500[4]，活产率为1/350～1/400[5]。常见的性染色体非整倍体是Turner综合征(45,XO)、超雌综合征(47,XXX)、超雄综合征(47,XYY)和克氏综合征(47,XXY)。性染色体非整倍体的患者表型差异巨大，到目前为止，尚无方法能准确预测患者将出现的临床症状。因此，对性染色体非整倍体患者进行产前筛查和诊断，有利于患者的进一步教育和医疗护理。目前除NIPT外，尚未发现其他能检测出胎儿性染色体非整倍体疾病的方法[6]。

本文通过统计2016年3月至2019年6月在深圳市第二人民医院行NIPT的16119名单胎孕妇中提示21-三体、18-三体、13-三体、性染色体异常和其他染色体异常的患者数量，同时对因“NIPT提示性染色体异常”的47名患者行羊膜腔穿刺术及染色体核型分析进行确诊。从而明确NIPT对染色体疾病的检出率，以及评价NIPT在性染色体异常中的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 基本资料 选取2016年3月至2019年6月在深圳市第二人民医院行NIPT的16119例单胎孕妇作为研究对象，所有检测的孕妇本人近期未接受过异体输血、移植手术和干细胞治疗等，并签署知情同意书，统计提示21-三体、18-三体、13-三体、性染色体异常和其他染色体异常的患者数量。选取2016年3月至2019年6月因“NIPT提示性染色体异常”在本院行侵入性产前诊断的47名患者，追踪随访染色体核型分析结果。

1.2 无创基因检测方法 采集5ml孕妇外周血，经离心后取上清血浆，按照核酸提取试剂盒操作说明书从中提取游离DNA，经修复末端、接头连接、PCR扩增和文库定量等，依托Ion Proton平台，使用BioelectronSeq4000高通量测序仪器进行高通量基因测序，测序结束后，用无创产前管理软件分析数据，计算出Z值，根据每个样本的Z值预测胎儿患染色体异常的风险比率。

1.3 羊水/脐血细胞培养和核型分析“NIPT提示性染色体异常”的患者，在充分告知其羊水/脐血穿刺风险的情况下，签署知情同意书。在超声定位下行羊膜腔/脐血穿刺术，抽取羊水30ml或脐血3ml，在遗传实验室行细胞培养，常规固定、制片和染色处理后，根据国际人类细胞遗传学命名体系(ISCN2009)进行核型分析及计数。

2 结果

2.1 NIPT对性染色体的筛查情况 16119例在本院行NIPT的单胎妊娠妇女均完成游离胎儿DNA的检测，结果共报告异常192例，筛查阳性率为1.19%。包括21-三体68例(筛查阳性率0.42%)，18-三体16例(筛查阳性率0.10%)，13-三体11例(筛查阳性率0.07%)，性染色体异常61例(筛查阳性率0.38%)，其他染色体异常36例(筛查阳性率0.22%)。

2.2 羊水/脐血细胞染色体核型分析结果 47例因“NIPT提示性染色体异常”在本院行羊水/脐血穿刺的孕妇中，经染色体核型分析，有26例被确诊为胎儿患有不同类型的性染色体疾病，阳性预测值为55.32%，假阳性率为44.68%。23例NIPT提示性染色体数目偏多者中，确诊为胎儿性染色体数目偏多的数量为21例，阳性预测值为91.30%，假阳性率为8.70%。其中13例确诊为47,XXY，4例确诊为47,XXX，1例确诊为45X[94]/47,XXX[6]，3例确诊为47,XYY。20例NIPT提示性染色体数目偏少者中，有2例确诊为45,XO，2例确诊为嵌合体，分别为45,X[9]/46,X,i(q10)[42]和45X[9]/46,XN[61]。阳性预测值为20.0%，假阳性率为80.0%。 NIPT提示性染色体数目异常者4例，确诊为性染色体异常者1例，阳性预测值为25%，假阳性率为75%。见表1和表2。

表1 2016年3月至2018年7月NIPT提示性染色体异常的病历资料

续表

373018+2性染色体数目偏多47,XXY一致382818性染色体数目偏多47,XXY一致392618+3性染色体数目偏少46,XN不一致403722+5性染色体数目偏少45,X一致412221+6性染色体数目偏多47,XXY一致422819+3性染色体数目偏多47,XXY一致432922+3性染色体数目偏少46,XN不一致442920性染色体数目偏少46,XN不一致452324+1性染色体数目偏多46,XXX一致463120+1性染色体数目偏多45X[94]/47,XXX[6]一致472821性染色体数目偏多47,XXY一致

表2 性染色体异常核型阳性情况

3 讨论

在NIPT应用于临床之前，若唐氏筛查提示异常，侵入性产前诊断便成了唯一的进一步检查手段，但因侵入性产前诊断可造成流产，导致很多孕妇拒绝行侵入性产前诊断。而NIPT可避免胎儿流产的风险，并且有较高的准确性[7]，因此成为了越来越多孕妇的选择。与唐氏综合征产前筛查相比，NIPT的检出率更高(96.52%比85.9%)，理论上将侵入性产前诊断的数量减少了60%，理论上也减少了73.5%的正常妊娠丢失率[8]。美国一家医院的回顾性研究显示，在2012年引入NIPT后，羊膜穿刺术和绒毛穿刺术分别减少了76%和54%[9]。

16119名在本院行NIPT的单胎孕妇中，不仅检测出了68例21-三体(筛查阳性率0.42%)、16例18-三体(筛查阳性率0.10%)、11例13-三体(筛查阳性率0.07%)，还检测出了36例其他常染色体异常(筛查阳性率0.22%)。表明NIPT也可以检测出除21-三体、18-三体和13-三体以外的其他常染色体疾病，但是本研究缺乏对这部分人群的追踪随访，无法得知确诊结果。从技术上来说，NIPT可以检测所有常染色体疾病。国际产前诊断协会(International Society for Prenatal Diagnosis，ISPD)表示，NIPT可以用于检测临床重要且意义明确的其他常染色体三体综合征。但是美国医学遗传与基因组学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)并不建议使用NIPT来检测除21-三体、18-三体和13-三体以外的其他常染色体疾病，美国妇产科医师学会(American Congress of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)也没有提及NIPT是否可以检测除21-三体、18-三体和13-三体以外的其他常染色体疾病。

16119名在本院行NIPT的单胎孕妇中，提示性染色体异常者61例(筛查阳性率0.38%)，筛查阳性率和国内同类研究基本一致[10]。有研究表明，45,XO 在妊娠中的发生率为1%～1.5%[11]，是首次妊娠流产的常见原因(占总流产率23%)[12]。47,XXX和47,XYY核型的个体表型是高度可变的，这种可变性可能是社会或认知方面的不足造成的。而47,XXY有典型的表型且与不孕相关[13]。性染色体疾病在胎儿期没有显性临床症状或超声异常[14]，早期和中期血清学筛查也不能检测出性染色体异常。除了NIPT以外，目前没有其他的方式能够筛查性染色体疾病，因此，NIPT在对性染色体疾病的筛查中显示出了越来越重要的地位。

国外一项前瞻性研究显示，NIPT对性染色体非整倍体的阳性预测值为48.4%(根据特定的性染色体三体，其阳性预测值的范围为30%～67%)[15]。47例因“NIPT提示性染色体异常”在本院行羊膜腔穿刺术或脐静脉穿刺术的孕妇中，经染色体核型分析确诊，有26例被确诊为不同的性染色体疾病，阳性预测值为55.32%，假阳性率为44.68%，和国外的研究基本一致。本研究中，对性染色体数目偏多的阳性预测值高达91.30%，表明NIPT对检测性染色体偏多有很高的准确性。而对于性染色体数目异常的阳性预测值为25.0%，表明NIPT对性染色体数目异常的检测准确性低。而对于性染色体偏少，本研究中的阳性预测值仅为20.0%。国内有研究表明，NIPT对45,XO的阳性预测值为0[16]，另一项研究显示，NIPT对45，XO的阳性预测值为40%[17]。可见，不同的研究均显示对性染色体偏少的阳性预测值均较低。

本研究中NIPT对性染色体数目异常和性染色体数目偏少的阳性预测值较低的原因，可能与以下因素有关。①X染色体上胞嘧啶和胸腺嘧啶含量的偏移；X和Y染色体高度同源，不易分辨，而且Y染色体和其他染色体有较多的相似片段，使测序性噪比降低[17]；②游离胎儿DNA的主要来源是胎盘滋养层组织，胎盘的染色体组成可能与胎儿不一样，这种现象被称为局限性胎盘嵌合现象，是游离胎儿DNA筛选试验产生假阳性结果的常见原因；③母体染色体核型异常：包括先前未知的母体嵌合体(例如低比例嵌合的母亲Turner综合征)和母体拷贝数变异[18]；④母源性肿瘤：2013年发表了第一篇关于游离胎儿DNA筛查结果假阳性，随后诊断为母亲恶性肿瘤的报道[19]。这可能和肿瘤细胞的细胞遗传学异常有关；⑤母体的健康状况，但是目前尚没有报道指出孕妇健康状况和NIPT结果的确切关系。

对于NIPT在性染色体非整倍体中的应用问题，ACMG在2016年发表的声明指出，应告知所有孕妇NIPT应用可以扩展到性染色体非整倍体筛查，并应告知患者NIPT对于性染色体非整倍体筛查假阳性率较高这一情况[20]。而ACOG建议所有孕20周内的孕妇，不论年龄，均可行NIPT[21]。

综上所述，NIPT不仅可以检测出常染色体异常，还能检测出性染色体异常。但是，由于NIPT对性染色体异常检测的假阳性率较高，因此，当NIPT发现性染色体异常时，需要进一步行侵入性产前诊断。与常染色体三体相比，大多数性染色体非整倍体患者，除了45,XO外，很少有严重的身体异常，这使得NIPT阳性者的产前咨询和决策复杂化。因此，提高NIPT对性染色体筛查的准确率非常重要。最近，NIPT已经扩大了游离胎儿DNA的检测范围，包括对性染色体非整倍体、微缺失综合征，甚至双胎的21-三体、18-三体、13-三体的检测[22,23]。随着数据积累，NIPT对性染色体异常的检测一定会越来越受到重视。