广东汉族人群Penta D基因座off-ladder稀有等位基因分析

兰菲菲 周伟宁 陈延冰 丁红珂

(广东省妇幼保健院 医学遗传中心，广东 广州 511442)

短串联重复序列(short tandem repeat，STR)是由2～8个碱基组成核心序列的一类DNA遗传标记，遵循孟德尔遗传定律[1]。STR基因座核心序列的重复数目在不同个体中存在差异，具有高度的遗传多态性，STR基因座的等位基因分型作为第二代法医DNA分型技术广泛应用于法医遗传学的亲权鉴定和个体识别[2]。目前应用于法医遗传学的检测试剂盒中等位基因分型标准物(allelic ladder)中包含了试剂盒所使用的每个STR基因座的人群中常见等位基因分型[3]。随着STR基因座遗传标记在法医遗传学应用的显著增加及不同种族和民族等位基因分型的差异，越来越多的等位基因分型标准物之外的(off- ladder，OL)等位基因被发现[4]。我们应用Powerplex21体系检测广东地区汉族人群中Penta D基因座的OL等位基因现象，并计算/命名OL的等位基因分型，正确判读鉴定结果，为广东地区汉族人群Penta D基因座OL等位基因分型提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 亲子鉴定家系来自广东省妇幼保健院2016～2018年受理的办理入户鉴定案件和个人了解的案件，筛选广东籍汉族人群列为研究对象。研究家系为生母、孩子和被检父的三联体亲子鉴定或者父子/女、母子/女的二联体亲子鉴定，签署知情同意书后采集血液样本。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取 血液样本按照Chelex-100法提取DNA。在1.5ml的离心管中加入1ml纯净水，取2μl全血加入，剧烈震荡后室温放置30 min。12000转/分室温离心3 min，弃上清后收集血细胞沉淀。加200 μl 5%的Chelex-100混合液，剧烈震荡后瞬时离心，56℃孵育30 min。100℃煮沸8min，13000 转/分室温离心3min，上清DNA保存于4℃备用。

1.2.2 PCR扩增 取DNA 1μl，按照Powerplex21体系(美国Promega公司)的说明书进行20个常染色体和1个性染色体STR基因座的PCR复合扩增。

1.2.3 STR基因座的等位基因分型 取PCR扩增产物1μl，每个孔加入8.5μl甲酰胺及0.5μl分子量内标，同时设置allelic ladder、阴阳性对照孔，充分混合后瞬时离心，95℃变性3 min后迅速置于冰上冷却5 min。用3500XL基因分析仪(美国AB公司)进行毛细管电泳，使用GeneMapperID-X软件分析，获得DNA的STR基因座等位基因分型。

1.2.4 STR基因座OL (off-ladder)稀有等位基因的计算/命名 以ladder作为分型标准，结合OL等位基因的片段大小和漂移率进行计算命名[5]。

2 结果

2.1 Penta D基因座STR基因座OL等位基因分型结果 利用PowerPlex21体系在三联体亲子鉴定案件的父亲和孩子中检测发现Penta D基因座存在OL等位基因(图1)，父亲的等位基因分型为10,OL；孩子的等位基因分型为9,OL；母亲的等位基因分型为9。

图1 Powerplex21体系检测Penta D基因座OL等位基因分型

2.2 Penta D基因座off-ladder等位基因的分型计算 根据OL等位基因的大小，结合基因分型标准物(allelic ladder)等位基因的大小，计算基因座的漂移率，进而计算OL等位基因的大小后进行分型命名。

3 讨论

亲权鉴定的实践和研究中，不同STR基因座的off-ladder等位基因现象国内外有报道，例如D13S317、D19S433、D21S11、D16S539、D3S1358、TPOX、THO1、D7S820和FGA基因座等[5，6]。OL等位基因一般分为两种类型：一种是超出了该基因座基因分型标准物(allelic ladder)的范围，在范围之外；另外一种是没有超出基因座的allelic ladder范围，在两个等位基因之间[7]。Powerplex21体系是由Promega公司研发生产的遗传学检测系统，广泛应用于人群遗传多态性和法医物证检测研究，能够同时检测20 个常染色体和1个性染色体STR基因座，但在国内没有应用该系统进行广东地区汉族人群Penta D基因座OL稀有等位基因的研究报道。本文发现的OL等位基因超出了Powerplex21体系中Penta D基因座Allelic Ladder的最大范围17，属于第一种类型。Penta D基因座位于人类21号染色体短臂(21q22.3)，是核心序列为5碱基(AAAGA)的重复序列，Powerplex21体系中采用JOE荧光标记，基因分型标准物(Allelic Ladder)的片段长度范围为377～450bp，Penta D基因座的等位基因分型标准物中核心序列重复次数范围为 2.2、3.2、5-17。该基因座的遗传多态性较高，有文献报道在Penta D基因座发现OL和稀有等位基因11.2、18、19等[8]，这些OL等位基因对于提高该基因座的个体识别能力具有重要意义。

遇到STR基因座出现OL等位基因时，根据Allelic Ladder的分型标准和漂移率计算命名，OL等位基因计算命名一般有两种情况：过滤漂移率之后，如果OL峰的片段长度变化是Allelic Ladder相对应峰的整数倍(X倍)，则计算为Allelic Ladder相对应峰大小±X；如果OL峰的片段长度变化不是Allelic Ladder相对应峰的整数倍，只是增加或者减少几个碱基(bp)，着计算为Allelic Ladder相对应峰大小.X(X为相差的碱基数)(例如相差1个碱基或者2个碱基分别为10.1、10.2)。本研究中，孩子Penta D基因座的OL等位基因，过滤掉漂移率(-0.09 bp)之后，OL等位基因(470.37 bp)比Allelic Ladder中Penta D基因座的等位基因17(450.27 bp)大20.19 bp，而Penta D基因座为五核苷酸的重复，即OL等位基因比Allelic Ladder中Penta D基因座的等位基因17大约4个重复序列(20.19/5=4.038≈4)，因此，OL等位基因命名为21(图2)。

父亲Penta D基因座的OL等位基因，过滤掉漂移率(0.03 bp)之后，OL等位基因(470.47 bp)比Allelic Ladder中Penta D基因座的等位基因17(450.27 bp)大20.17 bp，而Penta D基因座为五核苷酸的重复，即OL等位基因比Allelic Ladder中Penta D基因座的等位基因17大约4个重复序列(20.17/5=4.034≈4)，因此，OL等位基因命名为21(图2)。本研究在广东地区汉族人群中发现Penta D基因座存在OL等位基因21，该等位基因同时属于稀有等位基因，而且孩子与父亲同时存在OL等位基因，即孩子的OL等位基因21是来源于父亲的遗传，这种在亲代和子代中遗传的稀有等位基因发生频率非常低，在人群中的频率很小，因此，会对亲子鉴定中父权指数(PI)值和累积父权指数(CPI)值计算有很大的影响，进而影响亲子鉴定的鉴定结论。鉴于OL稀有等位基因非常小的人群频率，在计算OL基因座的父权指数时可以考虑使用该STR基因座的最小等位基因频率。本研究发现的OL稀有等位基因，可以作为Powerplex21体系中Allelic Ladder等位基因的补充，对于提高该检测体系及Penta D基因座的检测效能提供一定的应用价值。

图2 Penta D基因座OL等位基因大小