遗传性球形红细胞增多症家系ANK1基因新发剪切位点突变的不典型表型及表型差异探讨

丁红珂 潘小英 吴新华 张彦 吴菁 刘玲 曾玉坤余丽华 兰菲菲,*

(1.广东省妇幼保健院 医学遗传中心，广东 广州 511442；2.广东省妇幼保健院 妇幼代谢与遗传病重点实验室，广东 广州 511442；3.广东省妇幼保健院 信息管理科，广东 广州 511442)

遗传性球形红细胞增多症(hereditary spherocytosis，HS)是一种遗传性溶血性贫血，是由于基因突变导致红细胞膜蛋白缺陷而引起的贫血，发病率约为1/5000，临床表现为贫血及相关症状，且表现程度不一，存在一定的遗传异质性，通常表现为不同程度的贫血、黄疸、脾肿大、球形红细胞增多、红细胞渗透脆性增加等[1,2]。目前发现并证实的与HS发病相关的基因有ANK1、SPTA1、SPTB、SLC4A1和EPB42，分别编码锚蛋白、α血影蛋白、β血影蛋白、带3蛋白和4.2蛋白，参与红细胞膜之间的相互作用和脂质双分子层的构成，其中以ANK1基因突变最为常见[3-6]。HS大部分为常染色体显性遗传，少数为常染色体隐性遗传。

本文利用高通量测序方法发现临床表现不典型家系先证者和其父亲在ANK1基因存在一个剪切位点的杂合突变：c.4381+1delG杂合(转录本号：NM_000037)(chr8:41,688,155)，染色体位置参考GRCh38/hg38版本，该突变位点尚未见报道。同时分析该家系基因突变遗传学特点与临床表现的关系，并对第二胎进行产前诊断和遗传咨询。并为临床遗传咨询医生对HS临床表现型差异的认识提供更多的资料。

1 资料与方法

1.1 基本资料 实验样本来自广东省妇幼保健院医学遗传中心遗传咨询门诊患者夫妇和患儿，母亲为妊娠状态。患儿女性，11岁，出生后发现贫血，并伴有黄疸。辅助检查：血红蛋白在70～110g/L左右波动，间接胆红素升高58.5μmol/L，红细胞生存时间28天，网织红比例10.8%，红细胞渗透脆性增加，抗碱血红蛋白轻度升高3.25%。骨髓穿刺、末梢血涂片、地中海贫血基因、G6PD检查未见明显异常。腹部超声提示胆囊多发小结石，脾大(厚35mm，斜径106mm，肋下15mm)，怀疑为遗传性球形红细胞增多症，并对先证者及其父母进行了高通量医学外显子基因检测。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 经孕妇和家属同意，签署知情同意书后采集夫妻双方及先证者外周静脉血样本2ml。发现突变后，孕母于孕19周在超声引导下进行羊膜腔穿刺术抽取胎儿羊水5ml用于基因检测。

1.2.2 基因组DNA 提取羊水5ml用2000 rpm离心10min，丢弃上清留取羊水细胞待用。取外周血全血200μl及羊水细胞，使用Qiagen DNA Blood Mini Kit提取试剂盒(Qiagen公司，德国)提取基因组DNA，按照试剂盒的操作说明书进行DNA提取操作。

1.2.3 高通量外显子基因检测 提取的父母子家系DNA送广州嘉检医学检测公司进行医学外显子(与人类疾病相关的4000个基因)基因测序，测序范围包括50 902个编码区总共含有8 591 731个碱基，包含外显子与内含子交界区。平均覆盖深度 221+/-140×，大于 10×覆盖区间占99.7%，大于20×覆盖区间占99.2%。

1.2.4 疑似新发突变的一代测序验证 针对高通量测序发现的疑似致病位点，设计引物进行PCR特异扩增后Sanger测序进行验证。

1.2.5 测序结果分析 一代测序的结果与数据库的序列进行比对，确定二代测序发现的疑似致病突变。参考序列数据来自UCSC Genome Browser(http:∥genome.ucsc.edu)数据库，序列版本号：GRCh38/hg38。

1.2.6 产前诊断 告知疑似致病突变的临床意义，经家属知情同意后，用一代测序的方法进行胎儿产前诊断。

2 结果

2.1 高通量外显子基因检测结果 父母子核心家系医学外显测序发现先证者及先证者父亲ANK1基因存在一个剪切位点的杂合突变：c.4381+1delG(NM_001142446.2)，母亲未发现该突变位点(图1)。

图1 先证者家系的高通量测序结果(ANK1基因为反义链编码基因)

2.2 一代测序验证和产前诊断结果 Sanger测序结果显示，先证者、先证者父亲和胎儿该位点均为杂合。先证者父母经考虑后决定保留胎儿，后顺利分娩一女孩，目前5月龄，截至该文撰稿时血常规检查未发现异常情况(图2)。

2.3 突变位点致病性分析

2.3.1 人群频率 c.4381+1delG杂合位点，未见中国人群频率数据库收录(https:∥diseasedx.virgilbio.com/search?search=8:41688155Cdel&version=38)，提示人群频率较低，属于罕见变异，排除多态性可能。

2.3.2 软件预测 生物信息学软件预测提示可能影响剪切功能，分析预测值如图3。

图3 生物信息学软件预测结果

2.3.3 保守性分析 c.4381+1delG杂合(NM_000037)在物种间高度保守(图4)。

图4 c.4381+1位点物种间保守型分析(ANK1基因为反义链编码基因)

3 讨论

红细胞膜组成成分包括蛋白质、脂质和糖，胞膜蛋白主要由跨膜蛋白和外周锚蛋白组成。ANK1基因编码外周锚蛋白，HS的发病原因与ANK1基因突变导致锚蛋白异常有关，研究报道的ANK1基因突变有几十种[7,8]，突变导致HS的临床表现型也各不相同。ANK1基因位于8号染色体p11.2区域，42个外显子共编码1881个氨基酸[9]，具有不同的转录本。锚蛋白是红细胞膜蛋白的重要组成成分，主要功能是维持红细胞膜的稳定性。锚蛋白缺陷或者其他异常会导致红细胞膜不稳定，红细胞形状改变成球形[10]，容易发生破裂。本研究中先证者高通量测序发现ANK1基因存在c.4381+1delG杂合突变，遗传自父亲，该突变点位于经典的剪切位点上，软件预测可以导致mRNA产生新的剪切位点，影响野生蛋白结构。该突变位点国内外尚未见报道，结合先证者病史和临床表现，考虑该突变位点为疑似致病性突变。

HS的临床表现主要为不同程度的溶血性贫血、黄疸、脾肿大、红细胞球型改变、红细胞渗透脆性增加，HS的临床表现型差异较大，有的仅仅表现为轻微的贫血，容易漏诊或者误诊[11]。本研究中的先证者出生后发现有贫血症状，血红蛋白在70～110g/L左右波动，伴有黄疸。胆囊有多发小结石，脾肿大(厚35mm，斜径106mm，肋下15mm)，检测结果排除了G6PD和地中海贫血。实验室检查发现间接胆红素升高(58.5μmol/L)，红细胞生存时间降低，网织红比例增加，红细胞渗透脆性增加，抗碱血红蛋白轻度升高3.25%。骨髓穿刺无异常，血涂片并未见到球形红细胞改变，不属于典型的HS表现，提示该突变位点对锚蛋白的功能影响可能不是高度破坏性的，至少在维持红细胞的形态上没有明显的功能损害，推测可能与突变位置有关，该突变位点位于cDNA的后1/4区域，剪切位点，发生改变，从而影响了之后7个外显子的翻译，该蛋白的主要功能区位于第1～827位氨基酸的89 kDa结构域、第1234～1362位氨基酸的UPA结构域和第1383～1881位氨基酸的55 kDa调节结构域，本家系突变位于55 kDa调节结构域区域，剪切后产生新的氨基酸序列，未能完全破坏该蛋白功能，可能是导致先证者有红细胞渗透脆性的增加但并无球形红细胞典型表现的遗传学因素。先证者父亲外周血检测仅提示平均红细胞血红蛋白浓度MCHC值偏高(356g/L)，血涂片无异常，临床表现明显轻于先证者。这种表现型的差异，可能与个体之间不同的遗传背景相关，提示可能存在基因之间的相互作用关系。产前诊断提示胎儿也存在该位点突变，但家属经过考虑后决定继续妊娠，后正常分娩一女婴，目前血常规检查未提示有异常情况，需要进一步随访观察。

本研究发现的HS患者，由于其没有典型的球形红细胞改变，父亲只有轻度HS相关的临床表型，临床诊断容易漏诊或者误诊。通过基因检测发现该家系ANK1基因1个未见报道的剪切突变位点，且家系临床表型差异较大，丰富了ANK1基因的突变谱，同时提示该突变存在表现型差异，为临床诊断提供新的遗传学证据。