苯并[a]芘对脑内多巴胺能神经元和α-突触核蛋白的影响及其机制

祁宇泽，权会会，徐卫星，李清如，周 辉

(北京大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系，北京 100191)

苯并[a]芘[benzo(a)pyrene，BaP]是多环芳烃中重要的组成部分，广泛存在于空气、食物、土壤和水中，是人们生产和生活环境中常见的化学污染物。环境中BaP可以通过呼吸道、消化道和皮肤等途径进入人体，大量的动物实验和流行病学实验证明BaP是确认的致癌物，可以诱发肝癌、肺癌等恶性肿瘤。由于BaP具有高度脂溶性，其与代谢产物易穿过血脑屏障进入脑组织产生神经毒性。流行病学研究显示，BaP的职业暴露能够导致工人情绪异常、植物神经紊乱和短时记忆损伤，动物实验也发现，BaP能够导致动物平衡能力、空间学习和记忆能力损失[1-2]，还会诱导脑内神经元变性和死亡，最终引起神经退行性疾病样综合征[3]。

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见于中老年的神经退行性疾病，仅次于阿尔兹海默病，在中老年神经退行性疾病中排第二位。PD主要病理改变为中脑黑质致密部多巴胺能神经元变性死亡，以及在多巴胺能神经元中发现路易小体(Lewy bodies)， 其主要成分是α-突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)。α-syn是位于4q1-22SNCA基因编码的一个相对分子质量为19×103的小分子蛋白，由140个氨基酸构成。正常的α-syn具有水溶性，对于维持细胞膜结构和功能、调节多巴胺能神经递质释放、参与囊泡转运和调节突触前膜囊泡释放具有重要作用[4]。在PD的遗传学研究中发现了部分α-syn编码基因的基因点突变和异常扩增可以促使其异常折叠和聚集，形成不溶性的α-syn聚集体，参与形成路易小体。除此之外，研究发现，农药[5]、杀虫剂[6-7]、空气污染物[8]和交通污染物[9]长期暴露均有可能增加PD的发病风险。

环境中BaP的广泛和长期暴露能产生神经毒性，影响中枢神经系统功能，PD的发病也被证实与空气污染物、交通污染物等环境因素息息相关。但目前尚未见研究报道BaP暴露与PD发病之间是否存在关联，因此，本研究以表达人源α-syn的转基因小鼠为研究对象，采用BaP亚慢性暴露的方法，探讨BaP暴露是否会增加PD发病风险，是否会诱导运动功能障碍、黑质多巴胺能神经元减少、中脑α-syn增加等PD典型症状及病理改变，并探讨可能的作用机制，为进一步揭示BaP的神经毒性作用机制提供一定的依据和线索。

1 材料与方法

1.1 动物分组与处理

于南京大学模式动物研究所购买具有C57BL/C3H小鼠遗传背景，转入人源SNCA基因的转基因小鼠，可以过表达人源α-syn。繁殖和基因筛选后饲养于北京大学医学部实验动物科学部屏障设施内，屏障设施保持12 h/12 h昼夜循环，温度保持在(23±1) ℃，湿度为48%±10%，小鼠自由摄食和饮水。8月龄小鼠随机分为2组，即BaP染毒组和对照组，每组8只，BaP染毒剂量为1.0 mg/kg体质量(溶剂为玉米油)， 对照组给予玉米油，每天同一时间腹腔注射1次，连续染毒60 d。麻醉后心脏灌流处死小鼠，取出脑组织，一半置于4%(质量分数)多聚甲醛溶液中，4 ℃过夜固定后转移至30%(质量分数)蔗糖溶液，脱水后取黑质部制作30 μm冰冻切片；一半分离出中脑组织，储存在-80 ℃中。

1.2 动物行为学实验

转轮实验用于评价实验动物运动能力，将小鼠放置在转棒式疲劳仪上，启动仪器后，转棒开始与小鼠相反方向转动，小鼠在转棒上开始做强迫运动，观察其在转棒上开始运动至掉落时间，以评价动物反应、平衡、协调及运动能力。在染毒开始30 d、染毒结束后和染毒结束继续饲养30 d后进行转轮实验，每只小鼠实验3次，结果取平均值。

1.3 免疫组织化学检测黑质多巴胺能神经元死亡

取小鼠黑质部冰冻切片，加入3%(体积分数)过氧化氢溶液室温作用10 min，消耗内源性过氧化氢酶。加入封闭液室温封闭1 h，多巴胺能神经元特异性蛋白酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗体(1 ∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，对应的生物素化二抗(1 ∶1 000稀释)室温孵育1 h；生物素-亲和素-过氧化氢酶复合物溶液(avidin-biotin-peroxidase-complex，ABC)室温作用1 h；二氨基联苯胺显色液(diaminobenzidine，DAB)显色后脱水封片，使用Pannoramic SCAN Ⅱ拍照系统和Caseviewer软件观察、拍摄多巴胺能神经元，用Image J软件进行细胞计数。

1.4 免疫蛋白印迹检测蛋白表达

取小鼠中脑组织，加入含有PMSF和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取中脑组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后调整蛋白上样量为每样20 μg，使用15%(质量分数)的分离胶和4%(质量分数)的浓缩胶进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后转印至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上(孔径0.45 μm)。5%(质量分数)脱脂奶粉室温封闭1 h，α-syn一抗(1 ∶2 000稀释)4 ℃孵育过夜，对应的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记二抗(1 ∶2 000稀释)室温孵育1 h，ECL化学发光法显影成像后拍照，Image J软件进行灰度分析。

1.5 实时荧光定量PCR测定mRNA表达变化

取小鼠中脑组织，加入Trizol溶液进行中脑组织总RNA提取，按照试剂说明书配置逆转录反应体系，按照25 ℃ 10 min、50 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min程序从RNA反转录为cDNA进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)，使用SYBR Green染料，按照试剂说明配置反应体系并设定循环条件，循环条件为95 ℃ 5 min 1个循环预变性、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s 40个循环退火延伸。以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt法计算BaP组目标基因相对于对照组的变化倍数。所有引物均由Primer 3.0设计，上海Invitrogen公司合成。实验所用目的基因引物序列如表1所示。

表1 目的基因引物序列

LC3-Ⅱ, microtubules associated protein 1 light chain 3-β;Hspa1a, heat shock protein family A member 1A;Hsc70, heat shock cognate protein 70;Hsp90, heat shock protein 90;DAT, dopamine transporter;Vmat2, vesicular monoamine transporter 2;Synphilin-1, alpha synuclein interacting protein;GAK, cyclin-G-associated kinase;Htr1a, 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 1A;Htr1d, 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 1D;Htr5b, 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 5B;Adora2a, adenosine A2a receptor;Adra1b, adrenergic alpha 1B receptor;Drd1, dopamine receptor D1;Drd2, dopamine receptor D2;Gabra5, gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor alpha 5;Hrh3, histamine receptor H3;Lepr, leptin receptor.

1.6 统计学分析

使用Excel 2019整理实验所得数据，SPSS 20.0软件包进行数据统计分析。实验独立重复3次以上，数据以均数±标准差表示。转轮实验结果采用单因素重复测量方差分析，两组间均数比较采用Student’st检验，拒绝无效假设的显著性水平为0.05。

2 结果

2.1 BaP暴露影响小鼠运动能力

理论上，随着实验次数增加，小鼠会逐步适应转棒转动并掌握一定的在转轮上运动的技巧，落棒时间会相应延长。本研究对照组小鼠3次转轮实验中，落棒时间即逐渐上升(P>0.1)；而实验组小鼠第2个月落棒时间明显低于第1个月，第3个月落棒时间有所增加，但仍明显低于第1个月和对照组(P<0.05，图1)，说明在连续2个月染毒后，BaP暴露可以导致小鼠运动功能损伤。

2.2 BaP诱导黑质多巴胺能神经元死亡

正常生理状况下，实验所用α-syn转基因小鼠自身中枢神经系统表现为广泛的α-syn聚集，但没有黑质多巴胺能神经元死亡。对小鼠黑质多巴胺能神经元特异性蛋白TH染色后发现，注射BaP后，小鼠多巴胺能神经元明显减少，下降到对照组的62%，差异具有统计学意义(P<0.05，图2)，说明BaP可以诱导黑质多巴胺能神经元死亡。

2.3 BaP诱导中脑α-syn聚集体表达增多

除多巴胺能神经元减少外，免疫蛋白印迹结果表明，注射BaP后，小鼠中脑α-syn表达显著增多，为对照组1.36倍，差异具有统计学意义(P<0.05，图3)，提示BaP暴露促进α-syn聚集体形成和增多。

2.4 BaP暴露影响神经递质转运蛋白相关基因表达

BaP暴露影响神经递质转运蛋白mRNA表达，变化倍数大于1表示表达上调，变化倍数小于1表示表达下调。由表2可见，相较于对照组，多巴胺转运体(dopamine transporter，DAT)表达下调为24%(P<0.05)，囊泡单胺类转运体(vesicular monoamine transporter 2，Vmat2)表达下调为12%(P<0.05)。

2.5 BaP暴露影响神经递质受体功能

RT-PCR结果表明，BaP暴露导致神经递质受体功能相关基因mRNA表达发生显著下调，其中5-羟多巴受体5b[5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 5b，Htr5b]表达下调至对照组的20%(P<0.01)， 5-羟多巴受体1a[5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 1A，Htr1a]、γ-氨基丁酸受体5a(gamma-aminobutyric acid A receptor alpha 5，Gabra5)、组胺受体h3(histamine receptor H3，Hrh3)和瘦素受体(leptin receptor，Lepr)均下调至对照组的1/3以下(P<0.05，表2)。

2.6 BaP暴露影响α-syn降解和细胞自噬

表2显示，BaP暴露后自噬相关基因Beclin1、微管相关蛋白1轻链3-β(microtubules associated protein 1 light chain 3-β，LC3-Ⅱ)及热休克蛋白相关基因热休克同源蛋白70(heat shock cognate protein 70，Hsc70)、热休克蛋白家族A成员1A(heat shock protein family A member 1A，Hspa1a)、热休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)的mRNA表达量与对照组相比均显著下调，其中Beclin1表达量下调为34%(P<0.05)，LC3-Ⅱ表达下调为43%(P<0.05)；热休克蛋白基因Hsc70、Hspa1a和Hsp90的mRNA表达量分别下调至对照组的29%、22%和33%(P均<0.05)。

2.7 BaP暴露影响α-syn聚集体形成

α-syn聚集体相关基因主要包括α-syn相互作用蛋白(alpha synuclein interacting protein，Synphilin-1)、Septin4、细胞周期蛋白G相关激酶(cyclin-G-associated kinase，GAK)等，其中Synphilin-1会促进α-syn的聚集，Septin4相关蛋白表达可以保护α-syn免于自身聚集，GAK参与调解α-syn的表达和毒性。由表2可见，BaP暴露后Synphilin-1mRNA表达上调，上调倍数达3.52倍(P<0.05)；同时Septin4表达下调至对照组的18%(P<0.01)；而GAK表达与对照组相比差异无统计学意义。

表2 BaP暴露对基因表达的影响

Abbreviations as in Table 1.

3 讨论

BaP及其代谢产物由于其脂溶性，易于通过血脑屏障进入脑组织产生神经毒性，研究发现，经大鼠尾静脉单次注射BaP，1、6和24 h后可在海马、大脑皮层和纹状体中检测到BaP[10]，进入脑内的BaP可直接与芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AHR)结合，使AHR和其他伴侣蛋白(如Hsp90)分离，并与芳香烃受体核转运蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT)结合，形成BaP-AHR-ARNT复合物，之后与位于启动子区域的外源性物质应答原件相互作用，从而干扰多种脑内蛋白的表达[11]，导致神经毒性。本研究以能够表达人源α-syn的转基因小鼠为研究对象，分析BaP暴露后，小鼠黑质多巴胺能神经元和中脑α-syn变化状况，实验中观察到小鼠黑质出现多巴胺能神经元变性死亡和中脑α-syn表达增加等PD特征性病理表现，提示BaP暴露可能为PD发病的一个环境危险因素。

自从Jayasekara等[12]首先发现了BaP暴露对小鼠中枢神经系统的毒性以来，越来越多的研究表明BaP暴露导致的神经毒性主要影响中枢神经系统神经递质传递。脑内神经递质包括肾上腺素、去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺等，神经递质及其代谢产物对心血管、神经和内分泌等组织系统具有广泛的调节作用，并对睡眠、情感、情绪和应激行为等精神状况产生影响[13]。Stephanou等[14]通过向大鼠腹腔注射BaP进行染毒后发现大鼠新纹状体、下丘脑、中脑和大脑皮层等脑组织脑内去甲肾上腺素、多巴胺及其代谢产物均出现不同程度下降；Bouayed等[15]研究发现BaP经口低浓度暴露后影响神经递质相关受体基因表达，包括5-羟色胺受体、肾上腺素受体等。本研究中，BaP暴露后，5-羟色胺、γ-氨基丁酸、组胺和瘦素等多种神经递质受体mRNA表达下调，提示BaP通过影响神经递质受体产生神经毒性，与既往研究中BaP亚急性暴露改变神经递质的结果相一致。

神经递质转运蛋白在传递神经递质，参与神经元之间的信息传递中发挥重要作用，根据其基本结构和作用部位分为两个超家族：质膜转运体与囊泡膜转运体，其中DAT是一种质膜转运体，突触Vmat2是囊泡膜转运体的重要成员之一。在正常多巴胺能神经元末梢中，TH合成多巴胺后储存于突触囊泡，通过胞吐作用释放至突触间隙，部分通过DAT重摄入胞质，再经由Vmat2转运至囊泡，避免多巴胺过氧化[16]，二者在PD的发病机制中具有重要作用。本研究发现BaP暴露后DAT和Vmat2表达发生明显下调，提示在BaP暴露后，多巴胺重摄取受到抑制，造成多巴胺在突触间隙的淤积，多巴胺的重分布和稳态遭到破坏，一方面减少循环再利用的多巴胺，另一方面导致多巴胺酶促反应和非酶促反应增强，活性氧增多，造成神经元损伤和死亡。

α-syn的错误折叠和聚集是PD的重要病理性变化之一，在过表达α-syn的转基因动物模型中发现了由α-syn聚集形成的路易小体样病理变化和运动障碍的疾病特征[17]，在PD的发病和进展中起到了突出作用。在正常生理状态下，可溶性的α-syn通过泛素-蛋白酶体系统进行降解，也可以在溶酶体内通过细胞自噬途径降解[18]。在外界毒素作用下，泛素-蛋白酶体系统和细胞自噬系统遭到破坏，α-syn无法通过正常降解途径降解，促进其形成不易溶解的聚集体。研究表明，α-syn聚集体可以抑制泛素-蛋白酶体系统的蛋白降解作用；另一方面，α-syn聚集体与细胞自噬受体具有高亲和性，但无法通过自噬途径降解，从而抑制细胞自噬功能，导致α-syn聚集体不断积累，进一步引起内质网应激反应和线粒体损伤，最终导致神经元死亡[19]。本研究测定了蛋白降解和细胞自噬特征性标记物Beclin1、LC3-Ⅱ及热休克蛋白基因Hsc70、Hspa1a和Hsp90的mRNA表达，发现BaP暴露后，5种基因mRNA表达均显著下调。Beclin1和LC3-Ⅱ均为细胞自噬相关蛋白，其表达量升高表明自噬被激活，自噬体增多[20]；正常情况下，热休克蛋白可以促进自噬作用，而α-syn聚集体可以被热休克蛋白特异性识别并结合到溶酶体膜表面，抑制细胞自噬功能。本研究中，BaP作用后5种蛋白降解和细胞自噬相关标记物mRNA表达均明显下调，提示BaP有可能影响细胞自噬功能，抑制α-syn分解并促进其形成聚集体，α-syn聚集体又进一步抑制泛素-蛋白酶体系统与细胞自噬系统功能，导致神经元死亡，从而增加PD的发病风险。

综上所述，本研究观察到小鼠在BaP暴露后出现黑质多巴胺能神经元死亡和中脑α-syn表达增多的PD特征性病理表现，提示BaP暴露有可能增加PD发病风险，加快并加重其发病进程。进一步的mRNA表达检测结果表明，BaP暴露可能抑制神经递质受体与神经递质转运蛋白功能，阻碍α-syn降解和细胞自噬作用。本研究探讨了BaP暴露导致脑内多巴胺能神经元变性死亡和α-syn聚集体形成，从而增加PD发病风险的潜在毒性作用机制，为研究BaP在神经疾病中的毒性作用提供了一定依据。