纳米二氧化钛与葡萄糖亚慢性联合经口暴露对幼年大鼠血清叶酸和维生素B12水平的影响

陈章健，韩 硕，郑 湃，周淑佩，贾 光△

(1.北京大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系，北京 100191； 2.北京大学医学部实验动物科学部，北京 100191)

二氧化钛(TiO2)在食品领域的应用主要是作为食品添加剂[1]。美国食品与药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)在2002年认可二氧化钛为安全物质，对人体并无伤害[2]，我国也已正式公布二氧化钛可用于食品着色剂(GB25577-2010)， 并详细规定了二氧化钛的适用范围和最大使用量。但随着纳米技术在农业和食品工业领域的不断开发与应用，纳米材料在食品中的应用也越来越广泛[3]。近期的研究表明，纳米二氧化钛在食品和其他消费品中的含量不断增加，食品级二氧化钛中纳米颗粒的数量已达到36%左右[4-5]。同时，调查显示，纳米二氧化钛在口香糖、饮料和糖果等含糖量较高的食物中含量最高,儿童由于喜欢食用这些甜食而成为纳米二氧化钛的潜在高暴露人群，其摄入量约为成年人的2～3倍[5]。纳米二氧化钛常会与较高剂量的糖共同经口被儿童长期摄入，因此，研究纳米二氧化钛与糖类长期联合经口暴露对儿童的健康影响具有重要的现实意义。

纳米材料的特殊理化性质使其在生物体内表现出特殊的生物学作用，纳米二氧化钛在食品中的安全性研究受到关注。已有研究表明，肝脏可能是纳米二氧化钛的经口毒性靶器官，因此，其对营养物质的代谢可能会产生影响[6]。纳米二氧化钛经口摄入还可以加重胃肠道炎症，从而影响其吸收功能[7]。叶酸和维生素B12是维护神经系统功能健全不可缺少的维生素，同时在促进红细胞发育和成熟以及预防恶性贫血方面也发挥重要作用。它们的吸收和代谢如果受到影响将会导致机体出现严重的健康损害。近年来，纳米二氧化钛经口摄入导致神经系统和血液系统损害的相关文章不断出现[8]，生殖发育毒性造成的子代神经系统损伤也屡见报道[9]。因此，纳米二氧化钛很可能通过影响机体叶酸和维生素B12的代谢从而导致一系列的健康损伤。

本研究将探讨纳米二氧化钛与葡萄糖亚慢性(90 d)联合经口暴露对幼年大鼠血清叶酸和维生素B12的影响，并对两者可能存在的交互作用进行分析，希望为纳米二氧化钛经口毒性机制研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 纳米材料与表征

纳米二氧化钛购买于上海晶纯实业有限公司(阿拉丁试剂)。纳米二氧化钛的纯度使用电感耦 合等离子体质谱(inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS；IRIS Advantag，美国)进行检测，晶型使用X射线衍射仪(X-ray diffractometer，XRD；PANalytical’s X’Pert PRO，荷兰)进行分析，同时采用扫描电镜(NanoSEM430，美国FEI Company)检测纳米二氧化钛颗粒的形态和原始粒径。

1.2 实验动物

雌雄各40只清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠(3周龄，雌性体质量64～98 g，雄性体质量85～109 g)，购买并饲养于北京大学医学部实验动物科学部[许可证号：SCXK(京)2016-0010，SYXK(京)2016-0041]。适应性饲养1周后，按体质量随机分为8组，采用2×4析因设计，对照组(蒸馏水)、低剂量(2 mg/kg)纳米二氧化钛组、中剂量(10 mg/kg)纳米二氧化钛组、高剂量(50 mg/kg)纳米二氧化钛组和葡萄糖(1.8 g/kg)染毒组、低剂量纳米二氧化钛+葡萄糖染毒组、中剂量纳米二氧化钛+葡萄糖染毒组、高剂量纳米二氧化钛+葡萄糖染毒组，每组10只，雌雄各半。纳米二氧化钛的染毒剂量选择基于美国10岁以下儿童纳米二氧化钛的经口摄入估计量(0.5 mg/kg体质量)[5]，并使用100作为安全系数，计算得50 mg/kg作为大鼠灌胃染毒的最高剂量。葡萄糖的染毒剂量(1.8 g/kg)选择基于美国儿童和青少年附加糖(added sugar)的摄入量(360 kcal/d)[10]。葡萄糖的能量系数为4 kcal/g，青少年平均体质量以50 kg计算，因此，360 kcal/d相当于每天摄入葡萄糖1.8 g/kg。

1.3 大鼠灌胃染毒

将纳米二氧化钛或纳米二氧化钛加葡萄糖悬浮于蒸馏水中，使用前超声波分散10 min，并涡旋混匀。灌胃体积为1 mL/只，每天上午染毒1次，持续90 d，每日更换新鲜配制的纳米二氧化钛染毒液。每天观察记录动物的一般情况，每周称重。染毒期间，未观察到动物异常表现，各组动物体质量无明显差异。处死前禁食12 h，不禁水。动物实验遵循了北京大学生物医学伦理委员会和国家有关实验动物管理和使用的规定，伦理批准号LA2017073。

1.4 血清叶酸和维生素B12检测

染毒90 d后处死动物，取腹主动脉血1 mL促凝，1 500×g离心10 min，取上清液。采用放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)检测血清中叶酸和维生素B12浓度。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 纳米材料的物理化学性质表征

本实验所用纳米二氧化钛的物理化学性质在我们前期的文章中已有详细表征[11]。如表1所示，纳米二氧化钛的纯度为99.9%，晶体结构为锐钛矿，近球形颗粒，平均粒径为(24±5) nm。纳米二氧化钛(1 mg/mL)在水溶液中的水合粒径为40.8 nm，而在葡萄糖(0.2 g/mL)溶液中的水合粒径为74.5 nm，说明葡萄糖可以增加纳米二氧化钛在溶液中的团聚程度。同时，纳米二氧化钛(1 mg/mL)在水溶液中的Zeta电位为11.09 mV，而在葡萄糖(0.2 g/mL)溶液中的Zeta电位为4.62 mV，说明纳米二氧化钛在葡萄糖溶液中的稳定性出现下降，因此，团聚程度增加。

2.2 大鼠一般情况和体质量

如图1所示，纳米二氧化钛和葡萄糖联合经口暴露90 d内，大鼠从4周龄到16周龄左右，经历幼年期到成年期的生长发育阶段，体质量随时间不断增加，但相同染毒时间不同染毒组雌性和雄性SD大鼠体质量差异无统计学意义，说明在本实验所用剂量下，纳米二氧化钛和葡萄糖经口暴露对大鼠体质量无明显影响。同时，未观察到染毒期间SD大鼠一般情况出现异常，未见大鼠死亡。

2.3 血清叶酸

纳米二氧化钛和葡萄糖联合经口暴露90 d可导致SD大鼠血清叶酸浓度改变。如图2所示，与对照组相比，雌性大鼠葡萄糖染毒组血清叶酸浓度明显上升[(68.4±8.7) μg/Lvs. (55.8±4.8)μg/L]，雄性大鼠中剂量纳米二氧化钛+葡萄糖染毒组血清叶酸浓度明显上升[(81.4±20.8) μg/Lvs. (63.2±4.4) μg/L]，差异具有统计学意义(P<0.05)。与单纯葡萄糖染毒组相比，雌性大鼠低剂量和高剂量纳米二氧化钛+葡萄糖染毒组血清叶酸浓度均明显下降[(53.6±4.6)μg/L、(60.6±4.2)μg/Lvs. (68.4±8.7)μg/L]，雄性大鼠中剂量纳米二氧化钛+葡萄糖染毒组血清叶酸浓度明显上升[(81.4±20.8) μg/Lvs. (8.0±5.3)μg/L]，高剂量纳米二氧化钛+葡萄糖染毒组血清叶酸浓度明显下降[(55.2±7.3)μg/Lvs. (68.0±5.3)μg/L]，差异具有统计学意义(P<0.05)。雌性和雄性大鼠在暴露较高剂量葡萄糖后，纳米二氧化钛对其血清叶酸浓度的改变均具有差别，说明纳米二氧化钛和葡萄糖联合暴露时可能存在交互作用。

2.4 血清维生素B12

纳米二氧化钛和葡萄糖联合经口暴露90 d可导致SD大鼠血清维生素B12浓度改变。与对照组相比，各实验组雌性大鼠和雄性大鼠中血清维生素B12浓度未见明显变化，但与单纯葡萄糖染毒组相比，雄性大鼠低剂量纳米二氧化钛+葡萄糖染毒组血清维生素B12浓度明显上升[(662.0±61.8) ng/Lvs. (496.0±86.8) ng/L]，差异具有统计学意义(P<0.05，图3)。雄性大鼠暴露于较高剂量葡萄糖后，纳米二氧化钛对血清维生素B12浓度的改变具有轻微差别，这可能也与纳米二氧化钛和葡萄糖的交互作用有关。

2.5 纳米二氧化钛和葡萄糖的联合作用

经联合作用分析，纳米二氧化钛与葡萄糖联合暴露对SD大鼠血清叶酸浓度的影响存在交互作用。三维模拟结果显示，在雌性大鼠中，单纯纳米二氧化钛染毒时，血清叶酸浓度随剂量增加变化较小；单纯葡萄糖染毒时，血清叶酸浓度随剂量增加逐渐上升；当纳米二氧化钛与葡萄糖联合暴露时，血清叶酸浓度反而随着两者剂量增加出现下降，说明纳米二氧化钛与葡萄糖联合暴露对SD大鼠血清叶酸浓度的影响存在明显的拮抗作用(P<0.05，图4)。

3 讨论

本研究关注纳米二氧化钛和葡萄糖对大鼠血清叶酸和维生素B12的影响，叶酸和维生素B12都在维护神经系统功能方面发挥重要作用。近年来，纳米二氧化钛对神经系统的毒性作用受到广泛关注，研究表明纳米二氧化钛可穿过血脑屏障，积聚在大脑，尤其是皮质和海马[12]。无论是在体外还是在体内，纳米二氧化钛的暴露都会导致小胶质细胞的活化、活性氧的产生和炎症反应，进而激活细胞死亡信号通路，动物实验还观察到空间识别记忆和运动活动障碍[12]。目前，相关机制主要集中在纳米二氧化钛可以诱导神经炎症，进而产生脑损伤[12]。本研究从维持神经系统功能的关键营养物质叶酸和维生素B12的角度，探讨纳米二氧化钛导致神经毒性的可能机制。

本研究发现,纳米二氧化钛单独经口暴露并未对大鼠血清叶酸和维生素B12的浓度产生影响，但纳米二氧化钛与葡萄糖联合暴露时会导致大鼠血清叶酸浓度明显升高，这可能主要是高糖摄入的影响，叶酸代谢与能量代谢的关系是非常紧密的[13]。但与纳米二氧化钛同时暴露却可以降低葡萄糖的效应，在一般大鼠和摄入较高剂量葡萄糖大鼠中，纳米二氧化钛对血清叶酸浓度的影响不同，前者未见明显影响，后者可以导致血清叶酸浓度降低，说明纳米二氧化钛与葡萄糖在影响大鼠血清叶酸浓度方面存在明显的拮抗作用。这可能与葡萄糖可以增加纳米二氧化钛在溶液体系中的团聚程度有关(表1)， 纳米二氧化钛团聚程度越严重，水合粒径越大，相应生物学效应也会减弱，这在前期研究中已有所体现[14]，但是否为主要原因，仍有待深入研究。

表1 本实验所用纳米二氧化钛的物理化学性质

TiO2NPs, titanium dioxide nanoparticles.

我们的前期研究显示，幼年大鼠相比成年大鼠对纳米二氧化钛的经口暴露更加易感[15]，因此，本研究采用未成年的4周龄大鼠作为初始染毒对象。纳米二氧化钛经食物摄入人体应该是一个低剂量长期暴露的过程，因此，本研究采用连续90 d每日灌胃的方法，探讨经口摄入不同剂量纳米二氧化钛和葡萄糖的亚慢性毒性试验对SD大鼠血清叶酸和维生素B12浓度的影响，结果显示，纳米二氧化钛和葡萄糖连续经口暴露90 d后可以明显改变大鼠血清叶酸浓度，轻微改变维生素B12浓度。90 d染毒期结束时幼年大鼠已经进入成年期，尤其雌性大鼠已性成熟并可生育，如果此时雌性大鼠叶酸浓度降低，可能导致子代神经管畸形的风险显著升高。本研究结果显示，在高糖摄入雌性大鼠中，纳米二氧化钛可以显著降低血清叶酸浓度，这一结果提示，可能需要关注在高糖摄入儿童中纳米二氧化钛对其成年后叶酸浓度的影响以及伴随的后期子代神经管畸形风险。这与动物实验中纳米二氧化钛导致生殖发育毒性并进而造成子代神经系统损伤的报道一致[9]，但其具体机制以及其与纳米二氧化钛对叶酸浓度影响的因果关系尚不能确定。

纳米二氧化钛和葡萄糖联合暴露对大鼠血清叶酸和维生素B12浓度产生改变的原因可能主要是其影响了肝脏代谢和肠道营养吸收。肝脏是营养物质代谢的主要器官，叶酸和维生素B12均主要在肝脏代谢，此外，肝脏是纳米二氧化钛的经口毒性靶器官[6]，高剂量葡萄糖经口摄入也会对大鼠的肝脏功能产生影响[14]。因此，本研究中高剂量葡萄糖以及纳米二氧化钛+葡萄糖对大鼠血清叶酸和维生素B12水平的影响可能与其对肝脏代谢功能的影响密切相关。另外，前期研究显示纳米二氧化钛经口摄入诱导肝脏毒性存在性别差异，雌性更加敏感[16]。本研究也发现，雌性大鼠血清叶酸水平对纳米二氧化钛和葡萄糖亚慢性暴露更加敏感。性激素的影响可能是造成这种性别差异的原因之一，但具体机制还有待进一步研究。同时，纳米二氧化钛经口摄入还可以对胃肠道产生损伤，影响其吸收功能[7]。小肠是叶酸和维生素B12的主要吸收部位，我们前期的研究已表明，纳米二氧化钛长期经口摄入可以对大鼠肝脏葡萄糖代谢和小肠葡萄糖吸收产生显著影响[17]，提示纳米二氧化钛也可能通过这种途径对叶酸和维生素B12浓度产生影响。

综上所述，纳米二氧化钛与葡萄糖亚慢性联合经口暴露可以对幼年大鼠血清叶酸浓度产生影响，而且两者存在拮抗作用，但具体作用机制还有待于进一步研究。纳米二氧化钛在高糖摄入幼年大鼠中降低叶酸浓度的效应需引起关注。