144例维吾尔族与汉族女性子宫内膜癌微小RNA表达特点及临床意义

王 晓，贺 丹，李文婷，阿迪拉·斯依提，韩 蕊，董 颖△

(1. 北京大学第一医院病理科， 北京 100034； 2. 新疆医科大学附属肿瘤医院病理科， 乌鲁木齐 830011)

子宫内膜癌是妇科常见恶性肿瘤之一，发病率逐年上升且有年轻化趋势。近年我国每年新增病例近5万例，死亡近1.8万例[1]。临床病理实践中，内膜癌一直被分为两型(Ⅰ型和Ⅱ型)，绝大多数(80%～85%)为Ⅰ型癌，以内膜样腺癌(endome-trioid endometrial carcinoma, EEC)为代表，预后相对良好；Ⅱ型癌，即非子宫内膜样癌(non-endometrioid endometrial carcinoma, NEEC)，主要为浆液性癌和透明细胞癌，预后差。临床实践中仍有大约15%～20%的高级别子宫内膜样癌会术后复发，预后差，而部分早期的Ⅱ型内膜癌，预后相对较好。近年来，肿瘤基因组图谱中心(the cancer genome atlas, TCGA)基于高通量检测及数据分析，提示子宫内膜癌可分为4个分子分型[2]：(1)POLE基因超突变型，(2)微卫星不稳定高突变型，(3)低拷贝数型，(4)高拷贝数型。每个分子亚型都具有各自独特的分子异常，其预后及潜在治疗靶点不尽相同，肿瘤组织学类型也不一致。实际上，子宫内膜癌是一组异质性强的肿瘤，其本质是肿瘤分子特征的差异性。

子宫内膜癌的发病有地域差异，不同人种的发病特点也不完全一致，美国的研究数据显示，白人与黑人女性患病风险接近，但黑人女性更易患Ⅱ型内膜癌且晚期居多[3]。我们对近年新疆医科大学附属肿瘤医院收治的子宫内膜癌病例的分析显示，汉族女性子宫内膜癌病例远高于维吾尔族(约5～6倍)，但新疆地区的人口组成中汉族与维吾尔族已接近持平。新疆肿瘤医院是该地区唯一的肿瘤医院，其收治的病例大致反映出该地区肿瘤发病的特点，当前对维吾尔族与汉族女性子宫内膜癌的特点研究还缺乏对比分析。

微小RNA(microRNA，miRNA)是近年癌症研究的热点，它们是高度保守的非编码小RNA，结合于相应mRNA 3′端非翻译区，抑制mRNA翻译或促使其降解，在转录后沉默基因表达，参与胚胎发育、细胞增殖分化等重要生命活动。研究显示，miRNA异常表达与肿瘤发病密切相关，子宫内膜癌具有特征性miRNA表达谱，构成其独特复杂的调控网络，在肿瘤发生、发展的过程中扮演重要角色[4]。

本研究采用Taqman低密度芯片和实时定量PCR技术筛选和检测144例子宫内膜癌miRNA表达特点，并对比分析其在维吾尔族与汉族女性子宫内膜癌中的表达特点，阐述其临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集北京大学第一医院病理科近年来汉族女性子宫内膜癌石蜡组织82例(Ⅰ型癌53例，Ⅱ型癌29例)，新疆医科大学附属肿瘤医院62例维吾尔族女性子宫内膜癌(49例Ⅰ型癌，13例Ⅱ型癌)，分别以正常子宫内膜石蜡组织作为对照。标本经10%(体积分数)中性缓冲甲醛液固定，石蜡包埋，材料保存良好。所有病例在手术前均未进行治疗，由两位病理医师复阅切片，组织学分类参照2014版《WHO女性生殖系统肿瘤分类标准》[5]，并完善相关临床病理资料。两所医院病理科的组织病理标本前期固定、自动脱水的流程类似。

1.2 RNA提取

采用RNeasy FFPE(德国Qiagen公司)试剂盒提取石蜡组织总RNA，将5 μm厚石蜡切片6～8张置于EP管中，按照说明书操作。采用Nanodrop ND-2000分光光度计检测光密度值(D)，以评价提取产物中RNA的质量及浓度。D260 nm/D280 nm≥1.8者进行后续表达谱和实时荧光定量PCR检测。

1.3 miRNA表达谱分析

采用TaqMan低密度芯片(Taqman miRNA low-density array，TLDA)，对维吾尔族、汉族女性各1例浆液性癌以及各1例绝经期内膜组织为对照进行miRNA表达谱分析。芯片含A+B板，可以同时进行754条成熟人miRNA的检测(美国Applied Biosystems公司)。首先用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒将500 ng RNA逆转录为cDNA，引物采用Megaplex Primer Pools(含有低密度芯片中所有miRNA及内参照的逆转录引物)，再将逆转录产物cDNA加入到TLDA中，然后应用ABI-7900HT实时定量PCR仪分析，miRNA的表达情况使用SDS version 2.3 软件(美国Applied Biosystems公司)分析。

1.4 实时定量PCR检测

结合文献从表达谱中筛选出5个miRNA(miR-141、miR-200a、miR-205、miR-143、miR-145)，在维吾尔族与汉族子宫内膜癌石蜡组织中进一步验证分析其表达特点。逆转录方法同上，用TaqMan单管MicroRNA试剂盒(美国Applied Biosystems公司)检测并定量miRNA。以U6 小核RNA(small nuclearRNA, snRNA)作为内参照，每管反应重复3次，Ct值取平均值。肿瘤组织相对对照组织的差异倍数采用2-ΔΔCt法计算，ΔΔCt=ΔCt肿瘤组-ΔCt对照组=(Ct肿瘤组miRNA-Ct肿瘤组U6)-(Ct对照组miRNA-Ct对照组U6)。所有实时定量PCR检测均在北京大学第一医院病理科实验室完成。

1.5 免疫组织化学染色

采用Dako EnVision免疫组织化学检测试剂盒对4 μm石蜡组织切片进行免疫组织化学染色。抗体为DNA甲基转移酶3B(DNA methyltransferase 3B，DNMT3B)(52A1018，Abcam，体积比1 ∶250)。染色结果评估采用免疫反应评分(immunoreactive score, IRS)系统[6]，将IRS≥6定义为DNMT3B过表达，IRS<6定义为DNMT3B表达正常。

1.6 统计学分析

应用SPSS 20.0及Graphpad prism 6.0软件进行数据分析。正态分布的连续变量采用平均值±标准误表示，两组间比较采用t检验；分类变量采用卡方检验或Fisher’s精确检验，双侧P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 144例子宫内膜癌临床病理特点

本组144例子宫内膜癌包括维吾尔族患者62例，汉族患者82例。两民族之间子宫内膜癌发病年龄、组织学类型、临床分期等差异均无统计学意义，但汉族女性子宫内膜癌淋巴结转移率(27.5%)高于维吾尔族女性(9.8%)，差异有统计学意义(P=0.040)。

维吾尔族中49例为EEC，13例为NEEC，患者年龄33～77岁，中位年龄55岁，其中48例行全子宫切除术，41例同时行淋巴结清扫。临床分期：79.2%为Ⅰ期，4.2%为Ⅱ期，8.3%为Ⅲ期，8.3%为Ⅳ期。

汉族中53例为EEC，29例为NEEC，年龄37～80岁，中位年龄54岁，其中81例行全子宫切除术，40例同时行淋巴结清扫。临床分期：67.9%为Ⅰ期，14.8%为Ⅱ期，17.3%为Ⅲ期。

2.2 miRNA表达谱分析

应用TLDA对维吾尔族与汉族女性各1例浆液性癌和1例绝经期内膜对照进行miRNA表达谱分析，差异倍数≤0.125或≥8为界值。与正常对照相比，此例维吾尔族浆液性癌共有130个miRNA表达存在显著差异，其中59个表达降低，71个表达升高；此例汉族浆液性癌共有143个miRNA表达存在显著差异，41个表达降低，102个表达升高。

对比两例Ⅱ型子宫内膜癌miRNA的表达：两例患者中35个miRNA变化一致，其中均升高28个，均降低7个；有23个miRNA的表达特点截然相反(表1)。更突出的特点是93个miRNA在维吾尔族患者中轻微变化，但在汉族患者中显著升高或降低；90个miRNA在维吾尔族患者中显著升高或降低，但在汉族患者中变化轻微。

表1 维吾尔族与汉族Ⅱ型子宫内膜癌中表达差异的miRNAs

2.3 实时定量PCR法对比维吾尔族与汉族子宫内膜癌miRNA表达

以实时定量PCR法检测62例维吾尔族女性子宫内膜癌(对照组为正常内膜组织13例，包括7例增殖期、1例分泌期、5例绝经期)和82例汉族女性子宫内膜癌(对照组为正常内膜13例，包括9例增殖期、1例分泌期、3例绝经期)中，miR-141、miR-200a、miR-205、miR-143、miR-145的表达。在对照组的正常子宫内膜组织中，各miRNA在增殖期、分泌期和绝经期内膜及两民族间的表达差异无统计学意义。

2.3.1miR-141、miR-200a、miR-205在子宫内膜癌中的表达特点 与正常对照相比，子宫内膜癌中miR-141、miR-200a、miR-205的表达显著升高(P<0.05)。分组分析显示两民族表达特点类似，miR-141、miR-200a在维吾尔族表达更高，高于汉族，两者差异有统计学意义(P=0.020，P=0.028，图1，表2)。进一步分析显示，miR-141、miR-200a在维吾尔族EEC和NEEC中表达水平近似(表2)，而在汉族NEEC中表达更高，高于EEC，差异有统计学意义(P=0.029，P=0.010，表3)。miR-205在两民族间表达水平近似，在EEC和NEEC中差异也无统计学意义(P>0.05，图1)。维吾尔族EEC中，具有侵袭性临床病理特点的肿瘤miR-200a有表达更高的趋势，且高级别肿瘤中表达水平高于低级别肿瘤组，差异有统计学意义(P=0.044)，NEEC组无此特点(表2)，维吾尔族EEC中miR-141有类似表达趋势。汉族女性EEC和NEEC中，miR-200a表达与临床病理特点的关联性呈相反的特点，NEEC组miR-200a的表达更高，EEC组中具有侵袭性临床病理特点的肿瘤，miR-200a表达更低，而NEEC组具有侵袭性临床病理特点的肿瘤，miR-200a有表达更高的趋势(表3)，miR-205在不同临床病理特点分组间表达的差异没有统计学意义。

2.3.2子宫内膜癌miR-145、miR-143的表达特点 在144例子宫内膜癌中，与正常对照相比，子宫内膜癌中miR-143的表达降低，miR-145的表达升高。分组分析显示，miR-145、miR-143在维吾尔族与汉族中的表达特点相反，维吾尔族中表达升高，汉族中表达显著降低，差异有统计学意义(P均<0.001，图1)。与正常对照相比，维吾尔族Ⅱ型癌(NEEC)中miR-145升高更明显(P=0.001)，也高于Ⅰ型癌(差异没有统计学意义)，且在侵袭性相对不强的肿瘤(肿瘤级别低、肌层浸润浅、无淋巴结转移、无脉管浸润)中表达水平更高，其中，在肌层浸润深度<1/2的病例中miR-145显著升高(P=0.042)，其他指标未见显著差异(表2)。miR-143具有相似的趋势，另外，与正常对照相比，Ⅰ型癌(EEC)中miR-145和miR-143仅有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05，表2)。汉族女性EEC和NEEC中miR-145和miR-143表达均显著降低，但在EEC具有侵袭性病理特点的肿瘤中，miR-145和miR-143均降低得更明显，但差异无统计学意义(P>0.05)，NEEC不具此特点(表3)。

2.4 维吾尔族与汉族女性子宫内膜癌DNMT3B的表达特点及与miR-145、miR-143的关联性

Spearman相关分析显示，汉族女性子宫内膜癌中miR-145和miR-143与DNMT3B呈负相关(R=-0.256，R=-0.239)，差异有统计学意义(P=0.020，P=0.030)。

维吾尔族女性子宫内膜癌也存在较高的DNMT3B过表达(71.0%, 44/62)，且明显高于汉族(53.7%，44/82，P=0.035，图2)，但DNMT3B表达与miR-145、miR-143表达无明显相关性(P>0.05)。

维吾尔族与汉族EEC和NEEC的DNMT3B表达特点不尽相同，EEC中两民族DNMT3B的过表达率类似，而NEEC中，维吾尔族(84.6%)显著高于汉族(41.4%，图2)。同时，维吾尔族子宫内膜癌(包括EEC、NEEC)多数具有侵袭性病理特点的肿瘤中DNMT3B有过表达率更高的趋势(个别组未见此特点，可能与例数过少有关)，而汉族女性这一特点仅见于EEC，NEEC未见此特点(表4)。

3 讨论

子宫内膜癌发病有地域差异，不同人种发病特点也不完全一致。我们对新疆医科大学附属肿瘤医院近年收治的子宫内膜癌病例分析显示，汉族女性子宫内膜癌数量显著高于维吾尔族(598/92)，而且汉族淋巴结转移率(13.9%)高于维吾尔族(3.3%)[7]，与本组研究结果类似，目前对维吾尔族与汉族女性子宫内膜癌的差异性原因和机制还缺乏相关研究。

表2 miR-141、miR-200a、miR-205、miR-143、miR-145在维吾尔族女性EEC (n=49)和NEEC (n=13)中的表达

a, 48 Uygur women received hysterectomy; b, 41 Uygur women received lymphadenectomy. EEC, endometrioid endometrial carcinoma; NEEC, non-endometrioid endometrial carcinoma; SE, standard error.

表3 miR-141、miR-200a、miR-205、miR-143、miR-145在汉族女性EEC (n=53)和NEEC (n=29)中的表达

a, 81 Han women received hysterectomy; b, 40 Han women received lymphadenectomy. Abbreviations as in Table 2.

本研究以TaqMan芯片技术分析了维吾尔族与汉族女性NEEC中miRNA的表达特点，相对于对照的绝经期内膜组织，维吾尔族女性浆液性癌组织中59个miRNA表达降低，71个升高，汉族41个降低，102个升高。少部分miRNA(23个)在两民族中的表达特点截然相反，表达趋势一致的miRNA有35个，但更突出的特点是许多miRNA在一个民族中表达升高或降低，而在另一个民族中不表达或表达非常少(分别为93个和90个)。与以往文献数据和本课题组先前对汉族女性Ⅰ型癌miRNA表达谱的分析进行对照，83%异常表达的miRNA与以往文献报道一致，提示不同种族和人群的Ⅰ型内膜癌具有相对一致的miRNA表达特点[8-13]。同时，目前有限的针对Ⅱ型内膜癌的研究显示，Ⅰ/Ⅱ型癌大部分miRNA表达相似，少部分存在差异。有研究报道17个miRNA在两型内膜癌中的表达有显著差异，包括miR-675、miR-375、miR-570等[14]。以往文献研究结果间接提示维吾尔族与汉族Ⅱ型癌中差异表达的miRNA数量应该不会太高，与本研究结果似乎不完全一致，本研究结果可能间接反映出维吾尔族与汉族在种族、遗传背景等多种因素中有差异。另一方面，本研究仅分别用1例维吾尔族和1例汉族NEEC组织与各自1例对照组织进行miRNA表达谱分析，数据可能存在一定程度偏差。同时，不同研究采用的标准或侧重角度有所不同，也是导致结果差异的原因之一。

表4 维吾尔族与汉族女性子宫内膜癌中DNMT3B的表达特点

Abbreviations as in Table 2.

miR-200家族和miR-205在子宫内膜癌中普遍升高[15-16]，许多研究都证实这一现象，提示miR-200家族和miR-205可能是子宫内膜癌的肿瘤标志物。miR-200家族有5个成员，根据种子序列分为两组，miR-141/miR-200a为一组(AACACU)，miR-200b/miR-200c/miR-429为另一组(AAUACU)。本组数据与文献报道一致，144例子宫内膜癌中miR-141和miR-200a显著高表达，同时整体上维吾尔族的表达显著高于汉族。进一步分析发现，维吾尔族Ⅰ型癌(EEC)中，这两个miRNA升高的肿瘤更具侵袭性，而汉族中的特点相反，miR-200a表达升高的肿瘤侵袭性相对减弱。另外，汉族Ⅱ型癌(NEEC)中，miR-200a表达升高的肿瘤趋向更具侵袭性，而维吾尔族不具有此特点。miR-205在两民族的子宫内膜癌中均升高，EEC与NEEC中的表达特点没有明显差异。结合以往文献，本研究结果支持miR-141、miR-200a、miR-205高表达是内膜癌的主要分子特征之一，但miR-141、miR-200a在两民族间及不同组织学类型的子宫内膜癌中扮演的角色可能不同，其功能及相关机制值得进一步探讨。

miR-145及miR-143在中胚层起源的组织(包括子宫、卵巢和睾丸等)中高表达，在多种恶性肿瘤(如卵巢癌、大肠癌、膀胱癌等)中表达降低，被认为是最具普遍性的抑癌基因[17-18]。我们先前的研究显示，汉族女性子宫内膜癌组织中miR-145及miR-143的表达显著降低，特别是Ⅰ型癌，miR-145或miR-143低表达的病例有生存预后差的趋势，且与其预测靶基因DNMT3B呈负相关[19]。本组82例汉族女性子宫内膜癌的研究结果与先前结果基本一致，提示汉族女性内膜癌miR-145或miR-143的表达降低，解除对DNMT3B基因的靶向抑制，可能是DNMT3B高表达的因素之一。

62例维吾尔族女性子宫内膜癌的数据结果与汉族不同，首先，维吾尔族miR-145和miR-143的表达特点与汉族相反，呈显著升高，DNMT3B也显著过表达，且miR-145和miR-143表达升高与DNMT3B过表达均在Ⅱ型癌中更突出，但两者并无明显关联性，可能提示维吾尔族miR-145和miR-143的高表达并未抑制DNMT3B基因表达，可能存在miR-145和miR-143以外的因素参与DNMT3B的调节。

其次，维吾尔族中，miR-145和miR-143升高在Ⅱ型癌更突出，且miR-145和miR-143升高的肿瘤侵袭性相对减弱；而在汉族中，miR-145和miR-143表达降低的肿瘤更具侵袭性。另外，总体上汉族子宫内膜癌的淋巴结转移率高于维吾尔族，可能提示与miR-145、miR-143在维吾尔族中升高，发挥抑癌作用有关。

综上，我们对144例子宫内膜癌的分析发现，miR-141和miR-200a普遍表达升高，但在维吾尔族与汉族女性及Ⅰ/Ⅱ型子宫内膜癌中扮演的角色可能不尽相同。miR-145和miR-143在两民族子宫内膜癌中的表达特点相反，但无论在维吾尔族或汉族子宫内膜癌，miR-145和miR-143可能均发挥抑癌作用。维吾尔族与汉族女性子宫内膜癌的临床病理特点可能存在一定差异，上述miRNA表达差异及作用靶基因的差异可能与之有一定关联性。