中性粒细胞与淋巴细胞比例对评估接受过继性细胞免疫治疗的晚期胰腺癌患者预后的临床意义

姜 妮，乔国梁，王小利，周心娜，周 蕾，宋雨光，赵艳杰，任 军

(首都医科大学附属北京世纪坛医院肿瘤内科，肿瘤治疗性疫苗北京市重点实验室，北京 100038)

胰腺癌是常见的消化系统肿瘤，恶性程度高，预后差[1]。胰腺癌发病隐匿，大部分患者就诊时已为晚期，失去手术机会。晚期胰腺癌治疗研究进展缓慢，化疗是长期以来主要的治疗手段。尽管有研究报道，联合氟尿嘧啶或吉西他滨以及奥沙利铂、伊立替康、氟尿嘧啶联合化疗能使患者获益，但此类患者的生存期始终没有明显的改善或者药物副反应太大，患者难以耐受[2]。

T细胞过继免疫治疗作为一种针对恶性肿瘤的治疗手段在多种肿瘤的治疗上取得了不错的疗效，引起越来越多的关注，但针对晚期胰腺癌的研究报道不多。树突状细胞/细胞因子诱导的杀伤细胞(dendritic cell/cytokine induced killer, DC-CIK)是一种常见的过继免疫治疗方法，通过体外激活和扩增生成由DC、自然杀伤T细胞(natural killer T，NK-T)组成的混合物，输注该种混合物可以刺激机体产生肿瘤特异性T细胞应答。CIK细胞具有NK-T表型，同时表达CD56和CD3，介导非主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)限制的细胞毒性，而作为抗原呈递细胞的DC，当与CIK共培养时可以提高细胞增殖率并增强CIK的抗肿瘤活性，由于其快速增殖和抗肿瘤活性强，DC-CIK治疗被广泛应用于多种实体肿瘤中[3-4]。

S-1 (Taiho制药公司，日本东京)是一种含替加氟、吉美嘧啶、奥替拉西钾的口服复方制剂，其与氟脲嘧啶相比，在各种胃肠道恶性肿瘤中显示了非劣效性，且降低了氟尿嘧啶的胃肠道毒性[5-6]。在局部晚期和转移性胰腺癌的治疗中，单药S-1与吉西他滨相比，不仅口服便利、耐受好，而且治疗效果相当[7]，S-1一线治疗转移性胰腺癌也展示了令人鼓舞的效果[5]。此外，一项二期临床研究结果显示，S-1用于吉西他滨耐药的患者时，总反应率(overall response rate，RR)仍达到15%，中位无进展生存期(progression-free survival, PFS)为2.0个月，中位总体生存期(overall survival, OS)为4.5个月[8]。

一项前瞻性临床研究观察到，在晚期胰腺癌患者中，S-1与DC-CIK联合具有协同抗癌活性[9]，该研究中，接受S-1联合DC-CIK治疗、单独DC-CIK治疗、单独S-1治疗和最佳支持治疗的4组患者的6个月PFS分别为41.6%、9.1%、0、0，6个月OS分别为62.2%、18.2%、25.0%、0，差异均有统计学意义(P<0.001，P<0.001)。

越来越多的证据表明，癌细胞引起的系统性炎症活化可以诱导癌细胞增殖、转移或促进血管生成[10-11]。外周血中性粒细胞与淋巴细胞比例(neutrophil to lymphocyte ratio, NLR)被认为是全身炎症反应的标志物之一，对预测各种癌症的预后很有价值[12]。有研究表明，在接受过化疗或手术切除的胰腺癌患者中，治疗前NLR升高与预后较差有关[13-15]。目前暂时未见晚期胰腺癌患者接受T细胞免疫治疗中有关NLR的报道。本研究旨在评价晚期胰腺癌患者NLR的预后意义，特别是接受了DC-CIK免疫治疗的患者。我们还分析了NLR与T细胞亚型的关系，希望能更好地说明NLR与DC-CIK 细胞免疫治疗疗效是否具有相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究获得首都医科大学附属北京世纪坛医院伦理审查委员会的批准，所有患者均签署书面知情同意书。选取北京世纪坛医院肿瘤内科2013年6月1日至2016年5月30日就诊的患者，47例晚期胰腺癌患者符合研究标准，其中男22例、女25例，年龄36～79岁，平均(67.3±10.9)岁，TNM分期Ⅲ期7例、Ⅳ期40例，所有病理类型均为腺癌。患者分别采用DC-CIK细胞疗法单独治疗(n=11)、S-1单独治疗(n=4)、DC-CIK联合S-1治疗(n=25)、最佳支持治疗(n=7)。

1.2 入组标准

患者纳入标准：(1)年龄≥18岁且<80岁；(2)美国东部协作肿瘤组(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)体能状况(performance status，PS)评分0～2分；(3)通过组织学、细胞学和典型的影像学诊断，证实为胰腺不可切除、局部进展或转移性腺癌；(4)有客观可测量的肿瘤病灶；(5)前期未行免疫治疗或化疗；(6)除胰腺癌外，无并发恶性肿瘤；(7)重要脏器功能基本正常；(8)预期寿命>3个月；(9)签署知情同意书。

1.3 治疗方法

患者分为4个治疗组：DC-CIK联合S-1组、S-1组、DC-CIK组、支持治疗组。遵循本组之前研究的分组方法[9]，患者根据自身意愿选择入组。

DC-CIK的制备过程参见本组之前的研究[16]。皮下注射粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)， 动员骨髓中单个核细胞释放入血，通过分离外周血收集单个核细胞并进行体外扩增。使用COBE Spectra细胞分离机(COBE BCT, Lakewood, CO, USA)采集细胞，直到CD34+细胞≥4.5×106/kg(体质量)。25～50 mL的收集产物经淋巴细胞分层液区分为悬浮细胞及贴壁细胞，悬浮细胞加入干扰素-γ、白细胞介素(interleukin, IL)-2及CD3单抗体外共培养，产生CIK细胞；贴壁细胞与IL-4、肿瘤坏死因子-α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)体外共培养，产生DC细胞；7 d后两者混合培养。

S-1的剂量根据体表面积确定为：<1.25 m2，40 mg每日二次；1.25～1.50 m2，50 mg每日二次；≥1.50 m2，60 mg每日二次。每日早、晚餐后口服，连续口服14 d，休息7 d，每21天为1周期。治疗一直持续到疾病恶化或出现不可接受的毒性反应。DC-CIK细胞静脉输注20 min，每周期细胞回输分别在患者化疗第15天、17天和19天进行，每21天为1周期。回输细胞数量的中位数为7.8×109，治疗一直持续到疾病恶化或出现不可接受的毒性反应。

1.4 观察项目和指标

记录患者的病史和体格检查，患者每周期治疗前均行全血细胞计数、血清生化、肿瘤标志物及心电图检查，第1周期DC-CIK细胞治疗前及治疗后2周检查T细胞亚群，治疗前及疗效评价时行腹部和盆腔增强CT或MRI检查，必要时行胸部增强CT检查，定期随访。OS为主要观察指标，定义为从第1次治疗到死亡的时间。PFS为次要观察指标，定义为从第1次治疗开始直到疾病进展或死亡或出现第二恶性肿瘤。

1.5 统计学分析

采用SPSS 15.0软件进行统计学分析。连续变量表示为均值±标准差，用双侧独立t检验进行比较，分类变量比较使用卡方检验。采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC)评价NLR的预测价值，采用Kaplan-Meier曲线对生存率进行描述，用Log-Rank方法比较不同组间的差异。建立Cox比例危险模型，首先对单个危险因素与患者预后进行单因素分析，单因素分析有统计学意义的变量纳入多因素分析中，确定独立危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者特点

根据ROC曲线分析将患者分为NLR>2.5 (n=18)和NLR≤2.5 (n=29)两组，患者特征见表1，两组患者的基线特征差异无统计学意义。

2.2 与NLR相关的生存分析

本研究进行了ROC分析以确认NLR的截断值，最终确定将NLR>2.5 作为合适的截断值。NLR≤2.5组患者的OS(P=0.018，图1A)和PFS(P=0.033，图1B)明显优于NLR>2.5 组的患者。分层分析发现，DC-CIK细胞治疗组中，NLR≤2.5 的患者与NLR>2.5的患者相比，OS(P=0.032，图2A)及PFS(P=0.031，图2B)差异有统计学意义，有明显的生存优势。未接受DC-CIK细胞治疗的患者中，NLR≤2.5的患者与NLR>2.5的患者相比，OS(P=0.213，图2C)和PFS(P=0.562，图2D)差异无统计学意义。

2.3 与临床结果相关的预测因素

使用Cox比例风险模型进行多因素分析，在调整竞争风险因素后，NLR≤2.5和DC-CIK结合S-1仍然是PFS和OS的独立预测因子(表2)。

表1 患者的基线特征

ECOG-PS, Eastern Cooperative Oncology Group performance status.

2.4 外周血T细胞表型分析

外周血单个核细胞的表型分析显示，在治疗前及第1个周期结束后，CD3+和CD8+/CD28+T细胞亚群在NLR≤2.5的患者中显著增加(P<0.05)，CD8+/CD28-和CD4+/CD25+细胞亚群则显著降低(P<0.05，图3)。在NLR>2.5 的患者中只有CD3+T细胞亚群明显升高(P<0.05)。

3 讨论

本研究纳入的患者均为晚期胰腺癌患者，在过去的几十年当中，这部分患者的治疗效果有限，有些化疗方案虽然疗效肯定，但3～4级副反应的发生率很高，限制了方案的广泛使用。胰腺癌组织中的浸润淋巴细胞减少、髓样细胞功能异常、纤维组织增生明显及肿瘤细胞死亡受体下调，导致其免疫原性减弱，单纯的免疫治疗(如疫苗、检查点阻断剂、非特异性免疫调节剂、过继免疫治疗、溶瘤病毒等)也疗效甚微[17]。单一的治疗模式效果有限，但免疫治疗联合其他治疗方法却具有协同作用，如放化疗可以促进胰腺癌肿瘤微环境产生非特异性免疫反应，同时通过肿瘤细胞死亡、更多的肿瘤抗原释放，促进特异性抗肿瘤免疫，因此联合治疗已成为目前研究的热点。DC-CIK细胞治疗被证实对多种转移性实体瘤有效，因其副反应小、与其他治疗有协同作用,在癌症的治疗中得到了广泛的研究和应用。虽然由于技术标准、规范的操作规程和安全评价抗肿瘤疗效的标准体系尚未确立[18]，但作为一项潜在有效的治疗方法，DC-CIK治疗常与其他治疗手段联合使用以期增加疗效。近年来，DC-CIK联合化疗、DC-CIK联合PD-1抗体、质粒转染的DC-CIK治疗、非细胞来源的靶向肽负载DC-CIK疗法等取得了不错的效果[19-20]。DC-CIK与化疗联合治疗晚期胰腺癌比单一治疗的疗效更好，进一步寻找疗效预测因素成为进一步的研究目标。

表2 多因素Cox比例风险回归分析患者临床特征及生存

PFS, progression-free survival; OS, overall survival; ECOG-PS, Eastern Cooperative Oncology Group performance status; NLR, neutrophil to lymphocyte ratio; DC-CIK, dendritic cell/cytokine induced killer.

本研究显示，治疗前外周血NLR值是晚期胰腺癌患者生存时间的独立预测因素，与之前的研究报道相符[21]，然而，之前的相关研究中NLR的截断值多采用中位值，且不完全一致，降低了NLR的临床应用价值。我们认为NLR作为一个连续的变量，会受到患者基线及治疗方案的影响，因此探索不同群体、不同治疗方案的截断值有一定的临床价值。我们将NLR的截断值定为2.5，除了考虑统计的敏感性和特异性外，还考虑了其临床意义。本研究发现，NLR≥2.5组患者的生存时间明显小于NLR<2.5组，该差异主要体现在接受DC-CIK治疗的患者组。DC-CIK细胞回输提高了患者外周血淋巴细胞比例，对NLR产生影响，在低NLR组更为明显，进一步影响了治疗效果，故NLR在DC-CIK组患者的预后意义可能更大。低NLR预测CIK免疫治疗疗效显著，而高NLR则预示可能需要更多的CIK治疗周期或其他更强的免疫治疗来提高患者的生存率[22]。本研究未发现NLR在非DC-CIK治疗组中具有预后作用，不完全排除与该组患者中接受化疗的患者数量较少有关。

NLR具有预后价值的潜在机制主要在于浸润性中性粒细胞和淋巴细胞。肿瘤细胞引发了系统性的炎症反应，促进中性粒细胞浸润，通过分泌IL-2、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子α和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[23]，促进肿瘤扩散。VEGF是一种促血管生成因子，通过血管生成促进癌症的发展，肿瘤坏死因子α和IL-10的增加则导致淋巴细胞数量减少和功能障碍[24]。众所周知，淋巴细胞耗竭很大程度上反映了T细胞介导的抗肿瘤反应受损，是一个不良预后特征[25]。一般来说，中性粒细胞升高和淋巴细胞减少的相对比例可能是评价个体全身炎症反应和结果的科学指标，因此，NLR在一定程度上是评价预后的潜在指标。

本研究是一项小样本回顾性研究，今后应该进一步进行相关性研究。

综上所述，NLR升高可作为接受DC-CIK治疗的晚期胰腺癌患者预后不良的独立预测因素，NLR有助于评估接受免疫治疗患者的预后，并为高NLR的患者选择替代治疗方案。