肌动蛋白在不同衬底上的组装

张学强胡修源雷豪志汪 颖胡 钧张 益（中国科学院上海应用物理研究所 嘉定园区 上海 0800）（中国科学院大学 北京 00049）

肌动蛋白在不同衬底上的组装

张学强1，2胡修源1，2雷豪志1，2汪 颖1胡 钧1张 益11
（中国科学院上海应用物理研究所 嘉定园区 上海 201800）2
（中国科学院大学 北京 100049）

采用兔骨骼肌Actin作为研究对象，通过搭建原子力显微镜（Atomic force microscope， AFM）液相实时进样装置观察并对比G-actin在不同衬底上的组装过程。实验中发现，Actin在云母衬底上组装时形成较少的成核位点，然后组装成长达几十微米的纤维；而在带有正电荷的磷脂膜（DPPC：DPTAP=4：1）衬底上则快速大量地成核，组装形成较短的纤维。成像时所用的机械力应≤ 50 pN，所用的衬底应带有一定的正电荷。研究结果为构建Actin轨道上的纳米分子马达运输系统提供了依据。

原子力显微镜，肌动蛋白，自组装，分子马达

原子力显微镜（Atomic-force microscope， AFM）是由Binnig等［21］于1986年发明的高分辨显微镜，与传统的电子显微镜相比，其主要优点是可以在常温、液体环境下实现样品的高分辨成像，横向分辨率可达原子级，尤其适用于需要保持活性的生物样品的溶液状态下成像［22-23］。利用 AFM的液相原位成像技术，研究者们观察了众多存在于缓冲溶液当中并且具有生物学活性状态时的生物样品的结构，如细胞［24-25］、DNA［26-27］、生物膜及相关蛋白［28-29］、多肽［30-31］以及Actin［4，32-33］等，为理解生物体的结构与功能的关系作出了重要贡献。

在细胞内，F-actin作为负责囊泡输运的蛋白质分子马达肌球蛋白（Myosin）的运动轨道，承担着重要的生物学功能。而近年来的研究表明，F-actinmyosin体系可以被用来设计和构建具有特定功能的人工集成纳米生物机器［34］，在物质的微观输运方面有巨大的应用潜力。由于人工纳米生物机器需要在不同的基底上运行，因此，研究Actin在不同基底的组装行为，将为构建人工集成纳米生物机器打下基础。本文使用AFM在液相下实时原位成像的技术，观察了体外条件下由G-actin自组装形成纤维F-actin的过程，并对比了不同基底上G-actin的组装情况，分析了不同组装表现的可能原因，提出了G-actin在不同固液界面处可能的内在组装机理。

1　材料与方法

1.1材料

AFM 实验所用的探针型号为 BL-AC40TS-C2 （BioLever mini， Olympus），针尖悬臂梁的名义弹性常数为～0.09 N/m，液相中的共振频率为～25 kHz。云母（KAl2（Si3AlO10）（OH）2）购自四川美丰云母工业有限责任公司。磷脂膜 DPPC （1，2-dipalmitoyl-snglycero-3-phosphocholine）和DPTAP （1，2- dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane）购买自Avanti Lipids Polar， Inc.，制备方法同文献［35］。APTES （（3-aminopropyl）triethoxysilane）修饰的云母的制备方法见文献［36］。Muscle Actin，纯度＞99%，购买自美国Cytoskeleton公司。Tris碱、ATP（腺苷-5′-三磷酸 二钠盐 水合物），均为生物纯，购买自美国Sigma公司。HCl、CaCl2、MgCl2、KCl，均为化学纯，购买自中国国药集团化学试剂有限公司。

1.2方法

使用配备Nanoscope IIIa控制器、Multimode头部的AFM进行Actin组装研究。使用Liquid cell装置进行体外液相实时加样聚合，并选用 Tapping mode in fluid模式进行成像和显微操纵。实验中，通过调解Setpoint和Drive Amplitude产生所需要施加的不同大小的力。

取1 mg兔骨骼肌肌肉G-actin粉末（Cytoskeleton， Inc.）溶于浓度5 mmol/L ，pH=8.0的Tris-HCl、0.2 mmol/L CaCl2和0.2 mmol/L ATP组成的缓冲液中，冰上孵育60 min， 温度4 ℃条件下14 000 r/min离心15 min以除去可能聚集的肌动蛋白，取上清中的游离活化的 G-actin进行实时体外聚合实验，［G-actin］=400 µg/mL。聚合时，取适量的游离G-actin加入2 mmol/L MgCl2和50 mmol/L的KCl室温下聚合约 1 h即可得到 F-actin。制备好的 F-actin经Oregon Green® 488 Phalloidin （Life technologies）染色 20 min，聚合缓冲液冲洗 3次，通过Fluoromount™（Sigma）胶将F-actin样品固定在载玻片和盖玻片之间，过夜放置固定后置于LeicaSP8激光扫描共聚焦显微镜下观察。

2　结果与讨论

2.1肌动蛋白的形态表征

鬼笔环肽（Phalloidin）可特异性地与 F-actin结合，而不与G-actin结合［37］。由此通过给Phalloidin连上不同的染色分子，我们就可以利用荧光显微镜观察到形成的F-actin纤维。在实验中，我们使用染色分子 Oregon Green 488连接的 Phalloidin（Life technologies）来标记F-actin，然后利用激光共聚焦光学显微镜对所制备的样品进行了表征。图1（a）为激光共聚焦荧光图像，可以很清楚地观察到纤维状的F-actin已经形成。但限于光学显微镜的分辨率，我们并不能分辨出单根的F-actin纤维。图1（b）为使用原子力显微镜的Tapping in Fluid观察到的组装好的F-actin在APTES-Mica上面的图像，可以清楚地看到单根的F-actin纤维，并测得了单根F-actin的高度在（5±1） nm，纤维长度可达几十微米，考虑到在成像过程中，原子力显微镜的针尖会对样品施加一定大小的相互作用力，进而造成样品有轻微的形变，因此测得的高度值略小于理论值，如图1（d）所示。

2.2原子力显微镜下肌动蛋白在云母/水界面的实时组装过程

为了进一步了解G-actin的组装过程，我们搭建了AFM的液相实时进样装置，如图2所示。通过连续进样蠕动泵推动微量注射器缓慢地将聚合缓冲液注入到充满G-actin单体的AFM液池中，从而可以让G-actin较为缓慢地发生自组装形成F-actin，便于实验的观察。

G-actin的体外自组装需要满足两个条件，一是需要加入聚合缓冲液，二是单体的浓度要达到最低临界浓度［38］。聚合缓冲液通常由MgCl2、KCl、ATP组成，最低临界浓度随温度、缓冲液浓度而变化，本实验条件下G-actin的临界浓度约为30 µg/mL，实验中所采用的单体的浓度［G-actin］=40 µg/mL，略高于临界浓度，以保证单体能够顺利地组装形成F-actin纤维。在加入聚合缓冲液的同时，通过AFM在原位进行连续的扫描成像，从而记录下组装过程中发生的变化，得到的一组图像如图3所示。

云母基底在水溶液中由于表面的钾离子脱离进入到体相溶液中，从而造成云母的表面带有一定的负电性。同时由于G-actin在单体缓冲溶液中带有一定的负电性，所以云母表面只有较少的 G-actin单体，如图3（a）所示。当加入聚合缓冲液后，溶液中含有了Mg2+，它可以中和云母和G-actin的负电性，在云母表面形成较多的 G-actin聚集体，如图 3（b）所示。随着云母表面的 G-actin越来越多，G-actin单体之间相互碰撞，形成一些三聚体，这一步成为肌动蛋白组装的成核过程，成核过程由于能垒较高，是肌动蛋白组装的限速步骤［39］。成核之后，溶液中的G-actin单体会快速地沿着所成的核自组装，形成较长的F-actin纤维，这一步也称为肌动蛋白组装的延长过程。延长过程所需的能量较低，能够以很快的速度发生，最终形成长达几十微米的F-actin，如图3（c）～（f）所示。

实验中同时发现，肌动蛋白对AFM成像时针尖所施加到样品上的作用力的大小反应极为敏感，只有当所施加的力≤50 pN时才能保证组装形成的F-actin的结构不被施加的力所破坏。

2.3原子力显微镜下肌动蛋白在生物膜衬底上的自组装

肌动蛋白在非肌细胞中主要分布在细胞膜的内表面形成内皮层，起到维持细胞形态、信号转导、细胞变形等作用［15］。为了更真实地模拟细胞中肌动蛋白所处的微环境，我们进一步地研究了肌动蛋白在磷脂膜上的组装行为。

图4记录了G-actin在带有部分正电荷的磷脂膜上的组装过程。与在云母基底上的组装行为相似，G-actin首先组装形成较短的寡聚体，然后快速地组装形成较长的F-actin纤维。不同的是，在带正电荷的磷脂膜上组装形成的 F-actin长度较短，由单体G-actin组装形成F-actin纤维的时间也较短，这可能是由于磷脂膜所带的正电荷能够极大地促进G-actin组装的成核过程，从而能够在较短的时间内形成大量的成核位点；由于大量快速地成核以及后续的F-actin的生产阻挡了其它F-actin在基底上的延伸，因此只能形成较短的F-actin纤维。需要指出的是，G-actin在带正电荷的磷脂膜上的组装不需要添加聚合缓冲溶液［35］，可能的原因是磷脂膜上的正电荷屏蔽了G-actin单体所带的负电荷，并提高了磷脂膜表面的G-actin单体的局部浓度，从而使其更容易地发生自组装行为形成大量的F-actin纤维。

3　结论

利用激光共聚焦显微镜和AFM对体外组装的肌动蛋白纤维进行了形貌表征和实时组装过程的探究，通过实验发现，肌动蛋白在云母衬底上组装时形成较少的成核位点，然后组装成长达几十微米的纤维；而在带有正电荷的磷脂膜衬底上则快速大量地成核，组装形成较短的纤维。成像时所用的机械力应≤ 50 pN，所用的衬底应带有一定的正电荷。本实验的研究为进一步通过原子力显微镜构建基于肌动蛋白的分子马达轨道［40-41］及纳米生物运输系统［42］打下了基础。

致谢 感谢刘知晓博士提供的 F-actin染色标记方面的帮助，感谢王少朋博士在激光共聚焦显微成像工作上的支持。

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Study on the actin assembly on different substrates

ZHANG Xueqiang1，2HU Xiuyuan1，2LEI Haozhi1，2WANG Ying1HU Jun1ZHANG Yi11
(Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of Sciences, Jiading Campus, Shanghai 201800, China)2
(University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The assembly processes of actin on mica substrate and lipid membrane by real time imaging of atomic force microscope （AFM） and laser scanning confocal microscope were studied. It was found that on the bare mica substrate， the small amount of G-actin nucleating points formed and subsequently self-assembled into long actin filaments with lengths up to tens of micro-meters. While on the positively-charged lipid membrane （DPPC: DPTAP = 4:1）， large amounts of nucleating points quickly formed， leading to the formation of relatively shorter filaments. The proposed optimum condition for exploring actin assembly process with AFM in vitro is positively-charged substrates should be used while the AFM imaging force should be lower than 50 pN. These results laid foundation for construction of micro- and nano-scale transport systems based on actin.

Atomic force microscope （AFM）， Actin， Self-assembly， Molecular motor

CLC Q689

肌动蛋白（Actin）是一种广泛存在于所有真核细胞中的高度保守的蛋白分子［1-2］，也是细胞蛋白中含量最为丰富的分子之一。在肌细胞中，肌动蛋白约达到细胞蛋白总量的10%；即使是在非肌细胞中，也占到了细胞蛋白总量的1%～5%［3］。肌动蛋白的存在形式有两种：球形肌动蛋白（G-actin）和纤维肌动蛋白（F-actin）［4］。G-actin是游离的肌动蛋白单体，分子量为43 kD，经X-射线衍射结果推算其理论大小约为3.5 nm×5.5 nm×5.5 nm［5］，由单根肽链折叠而成，结构的内部含有一条狭缝，可结合核苷酸和二价阳离子［6-7］。在合适的条件下，G-actin可发生自组装形成F-actin。F-actin是直径约为7 nm的类似双螺旋状结构［8］，螺距约为 36 nm，结构上具有不对称性，可分为正极、负极两端。F-actin的正极端的组装速度大于去组装的速度，而负极端的组装速度小于去组装的速度，两者在某一蛋白浓度达到平衡，纤维的长度就保持恒定，这一现象称为“踏车效应”［9-11］。F-actin也可在一定的条件下发生去组装重新生成 G-actin。细胞中的肌动蛋白通过水解ATP将生物体内的化学能转化为机械能，进而使细胞能够进行诸如迁移［9， 12-14］、胞质环流［15］、分裂［16］、物质运输［17］、细胞黏附［18］、形成丝状伪足［19-20］和片状伪足［17］等功能，对生物体机能的正常运作起着至关重要的作用。

ZHANG Xueqiang （male） was born in October 1990 and graduated from Inner Mongolia University in 2011. Now he is a doctoral candidate in inorganic chemistry at Shanghai Institute of Applied Physics， CAS， E-mail: zhangxueqiang@sinap.ac.cn

21 March 2016； Accepted 16 April 2016

ZHANG Yi， professor， E-mail: zhangyi@sinap.ac.cn

Q689

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.040701

国家重点基础研究发展计划（2013CB932801）、国家自然科学基金（11274334）、中国科学院（KJZD-EW-M03）项目资助第一作者：张学强，男，1990年10月出生，2011年毕业于内蒙古大学，目前在中国科学院上海应用物理研究所攻读博士学位，无机化学专业，E-mail: zhangxueqiang@sinap.ac.cn

张益，研究员，E-mail: zhangyi@sinap.ac.cn

初稿2016-03-21；修回2016-04-16

Supported by the National Basic Research Program of China （grant No. 2013CB932801）， the National Natural Science Foundation of China （grant No. 11274334）， and the Chinese Academy of Sciences （grant No. KJZD-EW-M03）