H1299旁效应细胞对X-射线辐射的适应性与 TGF-β1通路相关

蒋友芹 田文倩 尹晓明 王敬东 杨红英

（苏州大学医学部放射医学与防护学院/放射医学及交叉学科研究院 苏州 215123）

传统放射生物学中的标靶理论认为细胞只有受到直接电离辐射，才会产生生物学效应。然而，近几十年来关于电离辐射诱导旁效应和适应性等现象的研究结果严重质疑了该理论的准确性。旁效应是指受照射细胞传递信号给未受照射细胞，从而使未受照射细胞发生一系列诸如基因表达改变[1-2]、基因突变[3-4]、DNA损伤[5-6]、细胞死亡[1,7]及恶性转化[8]等的生物学改变。目前为止，大量体外[1,8]、体内[9]证据证实了辐射诱导旁效应的存在。传统的适应性描述的是当细胞先用一个小剂量照射后，再接受大剂量照射时变得具有抗性的现象，这个现象在体内外均曾被观察到[10-11]。

近年来有证据显示电离辐射诱导的旁效应和适应性之间可能存在关联[12]。辐射诱导的旁效应细胞在受到大剂量照射时与适应性现象中的细胞预先受过小剂量照射一样变得具有抗性[13]。相反地，预先给予旁效应细胞一个低剂量照射可使旁效应不再出现[14]。然而这样的关联并非具有普适性。例如，研究发现辐射诱导的H460和A549旁效应细胞的辐射敏感性反而增加了[15]。这些看似矛盾的结果表明深入研究旁效应和适应性之间的关系将有助于对这些现象分子机制的理解。

研究显示转化生长因子 β1(TGF-β1)可能在辐射诱导旁效应现象中发挥着重要的调控作用[16-17]。加入TGF-β1抑制剂之后，T98G细胞辐射诱导旁效应现象（微核形成和细胞存活能力）消失了[16-17]，提示受照射细胞释放出的 TGF-β1信号因子可能作用于旁效应细胞，诱导旁效应细胞产生自由基，从而导致 DNA损伤[16]。但是 TGF-β1是否也在适应性中发挥重要作用却鲜有报道。另外，锰超氧化物歧化酶(SOD2)被发现参与了传统适应性反应的发生[18]。因此本研究以H1299人非小细胞肺癌细胞为研究对象，研究辐射诱导的旁效应细胞是否存在适应性的现象，并探讨TGF-β1信号通路和SOD2在此过程中可能发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

人非小细胞肺癌细胞H1299购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库；胎牛血清购自美国Hyclone公司；RPMI1640培养基、丙酮酸钠、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)和TGF-βR1抑制剂(SB431542)购自美国Sigma-Aldrich公司；HEPES缓冲液购自中国南京旋光科技有限公司；青霉素-链霉素、胰酶消化液和抗辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)购自中国碧云天生物技术研究所；抗SOD2小鼠单克隆抗体购自美国BD公司；化学发光剂(ECL)购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和辐照

H1299细胞以适当比例接种于含有10%胎牛血清、2.5g·L–1葡萄糖、1 mmol·L–1丙酮酸钠、100 U·mL–1青霉素、100 μg·mL–1链霉素及 1 mmol·L–1HEPES (pH 7.2)的 RPMI1640培养液中，放置于37 ℃、含5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，隔天换液。

细胞在 20℃下采用美国 RAD SOURCE RS2000 X-射线机进行照射，能量为160 kVp，距离为40 cm，剂量率为1.16 Gy·min–1。用来提取照射条件培养液的细胞吸收剂量为5 Gy，用来研究辐射适应性的吸收剂量为2 Gy。

1.2.2 条件培养液的提取

本文采用培养液转移法获得经培养液介导的辐射诱导旁效应细胞。取100–120万个细胞接种于100mm的培养皿中，培养24 h后，更换新鲜的培养液并用X-射线照射，剂量为5 Gy。继续培养1 h或18 h后，收集培养液并用无菌过滤器(Ф 0.22 µm)过滤以去除细胞碎片。为方便起见，在本文中提供旁效应信号的照射细胞被称为信号细胞，接收条件培养液处理的未照射细胞被称为旁效应细胞。照射后1 h和18 h收集的条件培养液分别被称为1 h照射条件培养液(1 h RCM)和 18 h照射条件培养液(18h RCM)。相对应的未照射组被称为未照射条件培养液(1 h SCM和18 h SCM)。另外，采用新鲜培养液作为空白对照(Control)。

1.2.3 克隆形成实验

取对数生长期的细胞制成单细胞悬液接种于60mm的培养皿中，每皿分别接种100个细胞，每个处理组设3个平行样。24 h后，去除原培养液，分别更换为新鲜培养液、1 h RCM、1 h SCM、18 h RCM或18 h SCM，继续培养13 d之后，弃培养液，用PBS快速洗3遍，甲醇固定15 min、亚甲基蓝染色30 min，用清水将培养皿洗净晾干。于显微镜下计数含50个细胞以上的细胞集落。克隆形成率和细胞克隆存活率按如下公式计算：克隆形成率(%) =（克隆数/接种细胞数）×100%；细胞克隆存活率 =处理组克隆形成率/对照组克隆形成率。

1.2.4 Western Blotting检测旁效应细胞的SOD2表达水平

旁效应细胞经过1 h RCM、1 h SCM、18 h RCM或18 h SCM培养3 h或5 h后，用预冷的PBS溶液冲洗 3遍，加入适量细胞裂解液（0.1%曲拉通X-100、10 mmol·L–1Tris (pH 7.4)、10%甘油、150 mmol·L–1氯化钠、5 mmol·L–1EDTA、1 mmol·L–1原钒酸钠、1 mmol·L–1苯甲基磺酰氟(PMSF)和 0.1%蛋白酶抑制剂），在4 ℃裂解30 min后，13000×g 4 ℃离心10 min，取上清，并用Bradford蛋白定量方法测定蛋白浓度。取适量样品并加入 1/4体积的5×SDS-PAGE上样缓冲液，95 ℃加热5 min使蛋白变性。然后用12%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白(200 V, 30-60 min)。等到蛋白分离完成后，将蛋白转膜至PVDF膜(100 mA, 2 h)。膜用含5%脱脂奶粉的 TBST(100 mmol·L–1Tris-HCl/pH7.5, 0.9% NaCl,0.1% Tween-20)进行非特异性封闭。加入抗 SOD2小鼠单克隆抗体4℃孵育过夜，膜用TBST溶液清洗3遍，加入二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)室温孵育45 min。膜用TBST清洗3遍，加入化学发光剂(ECL)，用多功能激光扫描成像系统（美国Amersham公司Typhoon 9410）进行曝光成像。

1.2.5 统计学方法

所有数据都是至少3次独立实验的平均，并用均数加减标准误差表示（±s)。采用Origin 8.0软件的 Student’s T检验进行组与组间的比较分析，p<0.05被认为两组间的差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各条件培养液对旁效应细胞的克隆存活率无影响

本研究采用培养液转移的方法，检测了X-射线诱导 H1299旁效应细胞的克隆形成能力的改变情况。如图1所示，与正常对照组相比，1 h 和18 h收集的未照射条件培养液并未改变旁效应细胞的克隆形成能力，且这两个时间点收集的照射条件培养液也未改变旁效应细胞的克隆存活率，提示X-射线不能诱导经培养液介导的H1299旁效应细胞克隆能力的改变。

2.2 H1299旁效应细胞对X-射线照射出现适应性

本研究探讨了用照射和未照射条件培养液培养的H1299旁效应细胞，经2 Gy的X-射线照射后，其细胞克隆存活率的改变情况。如图2a所示，与未受照射细胞相比，H1299细胞直接接受2 Gy照射后其克隆存活率降低了14% (p<0.01)；但如果细胞先在培养过未受照射 H1299细胞的条件培养液(1 h SCM)中培养24 h后再接受照射，其克隆存活率与未受照细胞相比只降低了4% (p=0.085)，与直接照射细胞相比却增加了12% (p<0.01)；而细胞如果先在培养过受照 H1299细胞的照射条件培养液(1 h RCM)中培养24 h后再接受照射，其克隆存活率竟超过了未受照射细胞，增加了约5% (p=0.068)，与直接照射细胞相比增加了22% (p=0.012)。并且，用长时间培养过未受照和受照H1299细胞的条件培养液(18 h SCM和18 h RCM)培养后再接受照射，细胞的克隆存活率进一步增加，与未受照细胞相比，分别增加了20%和31%，比直接照射细胞分别增加了38%和 52%（图 2b）。有意思的是，无论照后 1 h还是18 h收集的条件培养液，RCM培养过的细胞与 SCM 培养过的细胞相比，其受照后克隆存活率都约高10%。这些结果提示H1299旁效应细胞经未照射条件培养液培养后出现了对辐射的适应性，而照射条件培养液进一步增加了这种适应性，并且该适应性的大小与收集条件培养液的时间有关。

图1 H1299旁效应细胞经条件培养液(1 h SCM、1 h RCM、18 h SCM或18 h RCM)培养后的克隆存活率Fig.1 The clonogenic cell survival of H1299 unirradiated bystander cells cultured in SCM or RCM harvested at 1 h or 18h post-irradiation

图2 接受不同处理的H1299细胞受照后的克隆存活能力：(a) 1 h 条件培养液培养24 h后加照2 Gy；(b) 18 h条件培养液培养24 h后加照2 Gy(*代表两组相比，p<0.05)Fig.2 The survival fraction of H1299 bystander cells irradiated with 2 Gy X-rays after cultured in 1 h conditioned medium (a)or 18 h conditioned medium (b) for 24 h (*p<0.05 vs. relative controls)

2.3 H1299旁效应细胞的辐射适应性与 TGF-β1信号通路相关

为了探讨 TGF-β1信号通路是否参与了辐射诱导H1299旁效应细胞的辐射适应性，我们在照射前用 10 μmol·L–1TGF-βR1 抑制剂(SB431542)预处理信号细胞1 h或收集条件培养液后直接将SB431542加入到条件培养液中，然后用与上述相同的方法培养旁效应细胞，观察SB431542对辐射诱导H1299旁效应细胞辐射适应性的影响。10 μmol·L–1的SB431542对H1299细胞的短期增殖和长期克隆形成均无显著影响，SB431542联合2 Gy照射与单独照射相比，也未造成克隆形成率的显著降低（未发表数据）。图3显示，当信号细胞在照前用SB431542预处理1 h后，1 h SCM培养过的旁效应细胞经2 Gy照射，其克隆存活率比直接照射组低7% (p=0.34)，比未加SB431542组降低了20% (p =0.02)；1 h RCM培养过的旁效应细胞经2 Gy照射，其克隆存活率比直接照射组低11% (p=0.03)，比未加SB431542组降低了32% (p<0.01)。SCM组与RCM组间无显著性差异；而用18 h SCM和18 h RCM培养过的旁效应细胞经照射，其克隆率与直接照射组之间无统计学差异，却比未加 SB431542组分别降低了 19%和30%，并且SCM组和RCM组间也没有显著差异。这些结果显示当用SB431542抑制了信号细胞中的TGF-β1通路后，条件培养液诱导H1299旁效应细胞的辐射适应性消失了。另一方面，当 SB431542直接加到条件培养液中后，1 h条件培养液培养过的H1299旁效应细胞经2 Gy照射后，其克隆率仍较直接照射组高，与未加SB431542组无显著差异，并且 SCM 和 RCM 组间仍有 13%的差异，显示用SB431542抑制旁效应细胞自身的TGF-β1通路并不影响1 h条件培养液诱导旁效应细胞的辐射适应性；然而，用含有SB431542的18 h SCM和18 h RCM培养过的H1299旁效应细胞经2 Gy照射后，其克隆存活率较未加 SB431542组分别降低了 28%和18%，18 h SCM组甚至降至直接照射组水平，但是18 h SCM组和18 h RCM组间差异增大至24%，提示用SB431542抑制旁效应细胞自身的TGF-β1通路消除了未照射条件培养液诱导旁效应细胞的辐射适应性，但却增加了照射条件培养液和未照射条件培养液之间的差异。所有这些结果表明信号细胞和旁效应细胞中的TGF-β1信号通路对H1299旁效应细胞的辐射适应性有着重要的调控作用。

图3 TGF-βR1抑制剂(SB431542)对X-射线诱导H1299旁效应细胞辐射适应性的影响（*代表两组相比，p<0.05）Fig.3 The effects of SB431542 on the radiation adaptive response in bystander cells after cultured in conditioned medium harvested at 1 h and 18 h post-irradiation

2.4 照射条件培养液诱导旁效应细胞SOD2表达水平下降

我们通过western blotting检测了各条件培养液培养旁效应细胞3 h和5 h后细胞中SOD2的表达情况。如图4所示，1 h RCM培养3 h和5 h后，H1299旁效应细胞SOD2的表达水平均降低了；18 h RCM培养3 h后，H1299旁效应细胞SOD2表达水平没有明显改变，但是培养5 h后，H1299旁效应细胞SOD2表达水平发生了明显的下降。

图4 采用Western Blotting 检测各条件培养液培养3 h和5 h后，H1299旁效应细胞中SOD2表达水平改变情况Fig.4 The alterations of SOD2 expression in bystander cells cultured in conditioned medium harvested at different times post-irradiation for 3 h and 5 h, respectively, which was determined by Western Blotting

3 讨论

本研究证实虽然 X-射线不能影响 H1299旁效应细胞的克隆存活能力，却可以降低旁效应细胞的辐射敏感性，即旁效应细胞出现了辐射适应性。具体表现为与未照射培养液和未处理细胞相比，在照后1 h或18 h 收集的照射条件培养液均不能改变H1299旁效应细胞的克隆存活率（图1）。然而有趣的是，旁效应细胞经未照射条件培养液培养后加照2 Gy，其克隆存活率竟比单独照射组的高（图2），提示未照射条件培养液可在H1299细胞中诱导适应性反应，换句话说，H1299细胞自身就可释放某种信号因子给接收细胞使其产生辐射抗性；旁效应细胞经照射条件培养液培养后加照2 Gy，其克隆存活率不仅较单独照射组高，并且显著高于未照射条件培养液组（图2），表明X-射线诱导的H1299旁效应细胞出现了适应性反应，也即是X-射线诱导受照细胞产生信号因子，从而使旁效应细胞的辐射敏感性降低。这与文献[15]报道的结果不一致，该研究显示与接受未照射培养液处理后加照2 Gy的细胞相比，H460和A549细胞在接受其照射条件培养液处理后加照2 Gy，其克隆存活率显著降低，即旁效应细胞未发生适应性反应。巧合的是H460细胞和A549细胞刚好都具有野生型的tp53，而H1299细胞的tp53是突变型的。tp53是否在辐射诱导旁效应细胞的适应性中发挥某种作用需要进一步研究。这些结果与传统的适应性反应不相同，有研究发现传统的适应性反应发生在野生型tp53的细胞中，而不发生在突变型tp53的细胞中[20]。这些提示旁效应细胞的辐射适应性与传统的辐射适应性可能不同。另外令人惊讶的是，旁效应细胞接受2 Gy的X-射线照射后，其克隆形成率居然大于未处理细胞。研究发现，H1299细胞含有81.3%的CD44阳性细胞，而这些细胞同时表达多能性和间质转换的标志物，具有干细胞的自我更新和分化潜能的特点，成瘤效率较CD44阴性细胞高，对顺铂具有抗性，并且长期的顺铂处理将导致 CD44+细胞的比例增加到96.2%[21]；另一方面，2 Gy的γ-射线照射可以促进异质非干细胞肿瘤细胞群中肿瘤干细胞的形成[22]。因此我们推测所观察到的克隆形成率增加的原因可能是在此条件下，2 Gy的X-射线照射增加了旁效应H1299细胞中CD44阳性细胞的数目。该推测需要进一步的验证。

我们已有的数据证实 X-射线在 H1299细胞中诱导的旁效应产生过程中，受照信号细胞和旁效应细胞的 TGF-β1信号通路都被激活，并且对旁效应的各个终点（DNA损伤、ROS水平及细胞增殖等）的产生发挥着关键的调控作用（未发表数据）。本研究显示 TGF-β1信号通路对辐射诱导旁效应细胞的适应性反应起着复杂的作用。当信号细胞的TGF-β1信号通路被抑制后，条件培养液诱导的适应性不再产生，辐射诱导旁效应细胞的适应性也消失了。这些结果表明信号细胞中的 TGF-β1信号通路对旁效应细胞适应性反应的发生起着非常关键的作用。这些结果提示所观察到的适应性反应的确是由旁效应介导的，所以一旦通过抑制信号细胞的 TGF-β1通路来抑制旁效应后，旁效应细胞的适应性就不再发生了。另一方面，当旁效应细胞的 TGF-β1通路被抑制后，1 h收集的条件培养液诱导的适应性仍然存在，而18 h收集的条件培养液诱导的适应性都降低了，但照射条件培养液与未照射条件培养液之间的差异却增大了，提示旁效应细胞的 TGF-β1通路在不同时间点提取的条件培养液诱导的适应性反应中发挥的作用不相同，并且可能还有别的关键通路参与了旁效应细胞适应性反应这一过程。这些结果提示旁效应细胞的适应性与传统适应性可能源于不同的机制，因为研究发现传统适应性的发生与TGF-β无关[23]。

表明辐射诱导旁效应细胞的适应性与传统的适应性不同的另一个证据是旁效应细胞中SOD2的表达。在传统适应性反应中，低剂量电离辐射预处理细胞后导致SOD2表达上升[18]，从而介导了适应性的发生；但本研究发现旁效应细胞经照射条件培养液培养3 h 或5 h后，其胞内SOD2表达水平却下降了。我们已有的数据显示 1 h RCM 可以引起H1299旁效应细胞的miR-21表达增加，18 h RCM却导致H1299旁效应细胞miR-21表达下降（未发表数据）。而 miR-21可以通过 TNF-α间接调控SOD2[19]。因此miR-21表达的变化可能是本研究观察到的 SOD2表达下降的一个主要原因。但 1 h RCM和18 h RCM引起H1299旁效应细胞中miR-21不同的改变，却都引起了SOD2表达的降低，其中一个可能的解释是因为检测时间点的不同导致的，另一个可能的解释是SOD2还有别的调控机制。这些结果提示，SOD2可能未参与辐射诱导旁效应细胞适应性反应的发生，但这一结论还需要进一步的直接证据。

总之，本研究证实了电离辐射诱导的旁效应和适应性之间存在关联。伴随着H1299旁效应细胞中SOD2表达水平的下降，X-射线诱导的H1299旁效应细胞受照后发生了适应性反应；并且该适应性的发生依赖于信号细胞中的 TGF-β1信号通路，而旁效应细胞中的 TGF-β1信号通路发挥的作用比较复杂，与照后收集条件培养液的时间有关。研究结果还显示电离辐射诱导的旁效应信号可作为一个类似小剂量照射的传统适应性中的诱导剂，但辐射诱导旁效应细胞的适应性却不同于传统适应性，表现为SOD2和 TGF-β1信号通路在两种现象中的调控作用不同。

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