辐照对结冷胶分子量及其凝胶性质的影响

杨天怡 古立谦 朱 莉 詹晓北

1（江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室 无锡 214122）

2（日照职业技术学院食品工程学院 日照 286826）

3（江苏瑞光生物科技有限公司 无锡 214125）

结冷胶(Gellan gum)是一种由少动鞘氨醇单胞菌Sphingomonas elodea(ATCC31461)所产生的胞外微生物多糖[1]，主链由→3)-β-D-葡萄糖-(1→ 4)-β-D-葡萄糖醛酸-(1→4)-β-D-葡萄糖-(1→4)-α-L-鼠李糖-(1→线形四糖聚体重复单元组成，分子量约为5×105Da[2]。结冷胶产品分为两类：一类是天然的高酰基结冷胶，在每个重复单元上有1.5个O-酰基基团，其中每个重复单元上有1个O-甘油酰基，每隔一个重复单元有1个O-乙酰基，分别位于1→3链接成键的葡萄糖残基的第2位和第6位上[3]；另一类则是由天然结冷胶脱除部分或全部乙酰基的低酰基结冷胶[4]。结冷胶溶于水后，在降温过程中，分子会从无规则的卷曲状态转变成三折螺旋结构，稳定双螺旋结构的作用力主要是分子间氢键。一般认为阳离子的加入可形成“盐桥”，从而促进结冷胶凝胶结构的形成[5]。天然的结冷胶可生成富有弹性而且比较柔软的凝胶,与黄原胶、槐豆胶具有相似的性质,而低酰基结冷胶在加热冷却后强度大、易脆裂,与卡拉胶和琼脂的特性相似[2]。结冷胶是目前性能最为优越的生物胶之一，安全、无毒，具有低浓度、高效果、热稳定、纯透明、可再生、易被修饰和在可控制条件下生产等独特的理化性质，集增稠、悬浮及乳化稳定性等功能于一体，在诸多领域有着广泛的应用[6]。目前我国对结冷胶的应用主要是在食品领域，用做增稠剂、凝结剂、悬浮剂和成膜剂等[7]。

研究发现，运用分子修饰手段将多糖降解到适宜的分子量，得到较低分子量的多糖片段或寡糖，能显著提高其生物活性[8-9]，改善其理化性质使之在材料方面有更好的应用[10-12]。多糖辐照降解技术是利用γ射线以及电子束等电离辐射射线与多糖类物质作用，通过产生的物理和化学效应使被作用物中的糖苷键断裂，从而得到低分子量的产物的一种分子修饰手段[13]。该技术具有节省能源、反应易控、无污染、产品品质高等优点，物质经辐照降解后可得到均一性较好的产品，且生物相容性不受影响。国内对于黄原胶、茯苓多糖、壳聚糖、淀粉、海藻酸钠、纤维素、卡拉胶等多糖辐照降解已经均有报道[14]，而关于 γ-射线辐照对结冷胶的研究还是空白。本文旨在探索γ-射线对结冷胶分子量及其凝胶性质的影响，寻求一种降解结冷胶的新方法，为今后制备结冷胶寡糖和研究其寡糖生理活性打下基础，也为进一步开发利用结冷胶资源，扩大其应用范围提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

低酰基结冷胶，食品级，江苏瑞光生物科技有限公司。四甲基氯化铵，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。葡聚糖标准品，色谱纯，Sigma有限公司。DPPH· (1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼)，分析纯，Sigma有限公司。其余试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 辐照处理

空气中，常温常压下，60Co γ-射线辐照源，剂量率7 kGy·h-1，吸收剂量采用Ag2Cr2O7剂量计测定，该剂量计与国家计量院ESR剂量计NADS比对，剂量测定误差±5%以内。结冷胶固体粉末分别经过0、1、4、10、16和25 h处理（辐照剂量即为0、7、28、70、112和175 kGy）后分别标号a、b、c、d、e和f，作为样品待用。

1.3 测定与表征方法

1.3.1 电镜扫描

扫描电镜Quanta-200分别扫描样品，选取的放大倍数(Magnification, Mag)是160、300和2400。

1.3.2 粒径测定

激光粒径分析仪 Microtrac S3500分别测定样品，干法测定[15]，测试时间10 s。

1.3.3 分子量及分子量分布的凝胶色谱测定

样品制备：样品溶解于流动相中，用微孔过滤膜过滤后供进样。

仪器：Waters 600高效液相色谱仪（配2410示差折光检测器和Empower工作站）。

色谱条件[16]：色谱柱采用 Ultrahydrogel™Linear 300mm×7.8mm(i.d.)(内径，inside diameter)×2；流动相为 75 mmol·L-1四甲基氯化氨tetra-methyl-ammonium-chloride (TMACl)；流速为0.9mL·min-1；柱温：45 ℃。

分子量校正曲线的绘制：分别称取适量已知分子量的葡聚糖标准样品，MW2000000、MW133800、MW41100、MW21400、MW4600和MW180溶于超纯水后以保留时间与分子量的对数作出分子量校正曲线。

样品分子量及分子量分布的测定：根据分子量校正曲线以及样品的保留时间（排阻体积）求出其各组分的数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)和峰均分子量(Mp)，并按公式(1)计算多分散指数Polydipersity index(IPD)[12]。

1.3.4 红外扫描

在红外灯照下，取1 mg完全干燥的样品与100-200 mg完全干燥的KBr粉末在玛瑙研钵中研磨均匀，采用KBr压片后傅里叶红外光谱仪NICOLET NEXUS470在4000-600 cm-1区间扫描，扫描次数32。

1.3.5 溶液pH值测定

称取样品溶解于90 ℃蒸馏水中，配制成1g·L-1凝胶溶液，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，室温下静置3 h后测样，测试温度25 ℃。每个试验做3个平行样。

1.3.6 凝胶强度的测定

称取样品溶解于90 ℃蒸馏水中，配制成1g /100mL凝胶溶液，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，加入CaCl2粉末至Ca2+终浓度为5 mmol·L-1，继续加热搅拌1 min，趁热倒入玻璃器皿中，制成高30mm，半径 10mm圆柱，迅速放入4 ℃冰箱冷却，静置24 h后测样。每个试验做6个平行样。

采用TA.XT plus物性分析仪，探头型号P2，测定模式为压缩模式，测试前速率2mm·s-1，测试速率2mm·s-1，测试后速率10mm·s-1，测试距离10mm，触发力2g。

1.3.7 DPPH·清除能力测定

测定方法参考 Cheng[17]的实验方法并加以改动。精确称取 DPPH·粉末溶于无水乙醇中配制成0.208 mmol·L-1溶液；取样品溶于蒸馏水配置成不同浓度溶液，取20 μL样品溶液加入DPPH·无水乙醇溶液180 μL，于96孔板，震荡摇匀，避光反应30 min后使用全波长酶标仪 Thermo Scientific Multiskan Spectrum 在515nm波长下测定其吸光度Ai，同时测定以20 μL蒸馏水代替样品溶液的DPPH·溶液吸光度A0，和以180 μL无水乙醇代替DPPH·无水乙醇溶液的吸光度 Aj；并根据公式 2计算DPPH·清除率。抗坏血酸Vc作为阳性对照。每个试验做3个平行样。

清除率(Rsca, %)：

取样品溶于蒸馏水配置成不同浓度的溶液，取1.0mL样品溶液，加入3mL Tris-HCl (pH=8.2)，25 ℃水浴 20 min 后，加入 100 μL 10 mmol·L-1邻苯三酚（溶剂 10 mmol·L-1HCl），精确反应 4 min，滴入 100 μL 6 mol·L-1HCl终止反应，UV-1800 型紫外可见分光光度计在325nm处测定其吸光度Am，同时测定以1mL蒸馏水代替样品溶液的吸光度An和以 100 μL 10 mmol·L-1HCl代替邻苯三酚的吸光度A；并根据公式3计算清除率。抗坏血酸作为参比物，考察样品清除超氧阴离子的能力。每个试验做3个平行样。

清除率(Rsca, %)：

1.3.9 羟自由基(⋅OH)清除能力测定[18]

取样品溶于蒸馏水分别配置成不同浓度溶液，取 50 μL 样品溶液，加入 50 μL PBS(pH=7.4)和 50 μL 2 mmol·L-1EDTA-Fe溶液，再加入 10 μL 360 mg·L-1的番红花红T，最后加入40 μL 6% H2O2，放入全波长酶标仪Thermo Scientific Multiskan Spectrum中，振荡10 s使混合液混匀，25 ℃静置30 min后，于515nm处测定样品吸光度A，同时测定用50 μL蒸馏水代替50 μL不同浓度的样品空白组的吸光度Ai和用50 μL蒸馏水和40 μL蒸馏水分别代替50 μL不同浓度样品和40 μL 6%的H2O2的对照组吸光度A0；并根据公式4计算样品对⋅OH的清除率(%)。抗坏血酸作为参比物，考察样品清除⋅OH的能力。每个试验做3个平行样。

清除率(Rsca, %)：

2 结果与讨论

2.1 固态粉末颗粒粒径分析

扫描电镜可以观察结冷胶固体粉末颗粒形貌，激光粒径分析仪用来测粒径值，联合两者分析辐照对结冷胶固态粉末颗粒的影响。图1错误！未找到引用源。a-f分别是经辐照 0、7、28、70、112和175 kGy的结冷胶样品的电镜图。通过对比经过不同剂量辐照的结冷胶电镜图可以看出，辐照剂量的增加使得结冷胶小颗粒显著增加，且从高倍图中看出随着辐照剂量的增大其表面变得更为粗糙，说明辐照可能使结冷胶粉末粒径减小。

图2反映的是随着剂量的改变对应的结冷胶平均粒径的变化，由于结冷胶的颗粒大小本身是不均匀的，在这里是用平均粒径表征结冷胶颗粒粒径的改变。由图2中可以看出，随着吸收剂量的增加结冷胶的平均粒径逐渐降低，这表明随着吸收剂量增加，结冷胶小颗粒增多，大颗粒减少。综合来看，可以确认辐照使固态结冷胶粉末颗粒变小。

图1 固态结冷胶粉末经辐照后的扫描电镜照片a、b、c、d、e和f对应吸收剂量分别为0、7、28、70、112和175 kGy结冷胶样品从左到右放大倍数是160、300和2400Fig.1 Scanning electron microscope photograph of gellan gum in solid powder at different doses of gamma irradiation the absorbed dose of a, b, c, d, e, and f is 0, 7, 28, 70, 112, and 175 kGy, respectively.From left to right magnification is 160, 300, and 2400

图2 不同吸收剂量条件下固态结冷胶后的粒径Fig.2 Mean particle size of gellan gum at different doses of gamma-ray irradiation

2.2 分子量及分子量分布的凝胶色谱测定

葡聚糖分子量校正曲线如图3所示，根据校正曲线和样品出峰时间计算出样品的分子量及其PDI见表1。总体来看经过辐照的结冷胶分子的PDI值比没经过辐照的小，即辐照后分子分子量分布范围变窄，这应该是由于有大分子物质降解产生了小分子物质，分子量大的结冷胶分子链单元多，受辐射降解的几率也大，导致结冷胶分子量分布变窄；而由于辐照降解是无规则降解[19]，当随着吸收剂量增加到一定程度时，物质中多数分子分子量降低，所以PDI值又开始呈现波动。根据表1中重均、数均和峰均分子量分别对吸收剂量作图，发现随着吸收剂量的增大，结冷胶重均、数均和峰均分子量显著减小，且减小趋势慢慢变缓，呈现出指数函数的分布规律，在进行非线性最小平方拟合(Nonlinear least-squares fitting, NLSF)后均符合ExpAssoc模型且拟合情况良好，R2≥0.99，见图4，拟合结果见表2。

结冷胶分子量随着辐照剂量的增加而降低且PDI值呈现波动，说明经过辐照结冷胶分子链中的某些化学键发生断裂，才会产生了与结冷胶原分子量相比较小的不同分子量片段，证明辐照对结冷胶确实有良好的降解作用。这跟辐照对于壳聚糖，卡拉胶，海藻酸钠作用结果类似，而它们降解后形成的低聚糖的生物活性均有提高[14]；同时黄成栋[20]在把黄原胶降解后也发现其具有抗氧化活性和抑菌、抗病毒、植物诱抗活性；所以分子量降低的结冷胶降解的产物有进一步研究的价值，其生理活性和应用领域有待探寻。

图 3 葡聚糖分子量校正曲线Fig.3 GPC calibration curve obtained with dextran as the standard

表1 不同吸收剂量条件下固态结冷胶分子量及其分子量分布Table 1 Molecular weight and molecular weight distribution of gellan gum at different doses of gamma irradiation

表2 结冷胶分子量随辐照剂量变化的拟合方程结果Table 2 Molecular weight fitting results of gellan gum at different doses of gamma irradiation

2.3 红外光谱表征

红外谱图上吸收峰的位置与强度反映了分子结构上的特点，可用来鉴别物质的结构组成或确定其化学基团；而环境的变化和大分子物质的内部构造都可能造成同种基团吸收峰位置产生少量偏移[21]。在本实验中，3423 cm-1和2925 cm-1分别是-OH和C-H的伸缩振动峰[22]；1611 cm-1和1409 cm-1是结冷胶羧基特征吸收峰[21]，其中1611 cm-1是-C=O的伸缩振动，1409 cm-1是羧酸盐中的C-O-C环醚的伸缩振动[10]；1021 cm-1为羧酸配体的伸缩振动峰，890 cm-1是存在β-型糖苷键的特征吸收峰，540 cm-1是-C-C-O的变形振动[23]。

在图5中，结冷胶红外特征吸收峰出峰位置保持稳定，表明其组成基团基本类型不变，糖苷键类型不变。3423 cm-1处的强吸收峰是-OH的特征吸收，由于被测样品为固体粉末，-OH大多以缔合形式存在，所以此吸收峰很宽，从强度上分析，γ-射线的照射并没有对-OH造成显著影响。经过辐照的结冷胶样品1611 cm-1至540 cm-1处峰的振动增强，推测经过辐照的结冷胶有羰基结构生成，而羰基结构的生成应是由 C-O-C糖苷键断裂所致，说明辐照很可能使结冷胶分子链中糖苷键发生了断裂，生成羰基类化合物，结冷胶被降解导致分子量降低。

图5 不同剂量条件下的结冷胶的红外光谱图Fig.5 Fourier-transform infrared spectra (FT-IR) of gellan gum at different doses of gamma-ray irradiation

2.4 溶液pH测定

从图6可知，固态结冷胶经辐照处理后的水溶液pH值降低，并且随着吸收剂量的增加逐渐减小。综合红外图谱和分子量测定的结果进行分析，可认为pH值的降低是由于辐照使结冷胶分子链断裂，形成了羧基，引起溶液pH值减小。

图6 不同剂量下的结冷胶溶液pH值Fig.6 pH value of gellan gum at different doses of gamma-ray irradiation

2.5 凝胶强度表征

不同辐照强度的结冷胶凝胶强度见图 7，随着吸收剂量增加，凝胶强度减小，在0-28 kGy剂量范围，凝胶强度降低得快，28-112 kGy剂量后，凝胶强度降低趋势减缓，在剂量为112 kGy时，凝胶性能已经十分低下，当辐照强度在175 kGy时，在本实验条件下已经无法形成凝胶。

通过曲线拟合，求得拟合方程：

式中，y为凝胶强度(g),D为吸收剂量(kGy)。

由于结冷胶凝胶合成机制认为是阳离子引发的双螺旋间的聚合交连，阳离子促进分子内的交联作用、稳定双螺旋结构和加速双螺旋形成三维网络状结构[24-25]。综合之前的实验结果，表明在175 kGy下无法形成凝胶是由于辐照引起结冷胶分子链断裂，分子量过小，推断其已经无法构造成稳定的三维网络结构所致。9看出，没有经过辐照的结冷胶清除·的效果几乎为0，而辐照剂量在175 kGy时，5g·L-1结冷胶溶液的清除率达到 97.5%，可以达到 Vc效果的98.8%，在此条件下清除效果良好。对·清除效果与辐照剂量和结冷胶浓度均呈现正相关。

图7 不同剂量结冷胶凝胶强度拟合曲线Fig.7 The gel strength fitting curve of gellan gum at different doses of gamma-ray irradiation

2.6 抗氧化活性表征

2.6.1 DPPH·清除能力测定

DPPH⋅自由基有单电子，经过全波长扫描，在515nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使吸收逐渐消失，DPPH⋅法被广泛应用于测定生物试样和食品的抗氧化能力。由图8中可以看出，随着辐照剂量的增加，结冷胶溶液的DPPH⋅清除率总体增加，且与结冷胶浓度呈现正相关；当辐照剂量为175 kGy时，5g·L-1结冷胶 DPPH·清除率达到66.9%，说明辐照后的结冷胶对 DPPH⋅清除作用增加，体现了其抗氧化活性增加。这可能是由于结冷胶分子链断裂，暴露出的活性基团增多所致。2.6.3 羟自由基(⋅OH)清除能力测定

图9 不同剂量下结冷胶对·的清除率Fig.9 · scavenging rate of gellan gum at different doses of gamma-ray irradiation

Fenton 反应体系(Fe2++ H2O2→Fe3++⋅OH+OH-)产生的⋅OH可以使番红花红T褪色，番红花红T在520nm有最大吸收，在添加适量的抗氧化剂的条件下，其褪色情况减弱，从而可以通过测定吸光度值的变化来测定抗氧化剂清除⋅OH的能力。由图 10看出，当辐照剂量较低时，⋅OH清除能力与没经过辐照的效率相当。当辐照剂量达到28 kGy时，结冷胶溶液对⋅OH清除率明显增加，抗氧化活性提高，随着辐照剂量增加到112 kGy时，清除率达到最大值70.4%，在175 kGy时，清除率减小。清除效率与结冷胶浓度均呈正相关。

图10 不同剂量下结冷胶对⋅OH的清除率Fig.10 ⋅OH scavenging rate of gellan gum at different doses of gamma-ray irradiation

3 结论

60Co γ-射线辐照对结冷胶降解作用显著，首次发现经辐照降解的结冷胶寡糖具有抗氧化活性。辐照后的结冷胶随着辐照剂量增加分子量降低，凝胶强度减小直至消失。本研究证明了辐照确实是一种有效的降解结冷胶的手段，对于推广辐照降解多糖和制备有活性的寡糖方面有重大的现实意义，对于后续研究结冷胶寡糖的生理活性做出了前瞻性的工作。

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