电离辐射后肿瘤相关成纤维细胞中差异表达基因的生物信息学分析

杨宇虹 李 娜

1（永州职业技术学院医学院公共基础学部 永州425100）

2（湖南医药学院第一附属医院病理科 怀化418000）

3（湖南医药学院侗医药研究湖南省重点实验室 怀化418000）

肺癌是当前全世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，且其发病率仍呈逐年上升趋势，严重危害人们的身心健康［1］。肺癌的早期症状不明显，因此，临床上大部分患者在确诊时往往已是中晚期，放化疗成为治疗的主要手段［2-3］。放疗是利用各种不同能量的射线照射肿瘤，以抑制和杀灭癌细胞的一种治疗方法，是肿瘤综合治疗的重要组成部分，可以明显提高癌症的治愈率［4］，但往往会产生组织损伤、骨髓抑制等毒副反应，并且有较高的复发率。因此，探讨电离辐射的毒理机制具有重要的临床意义。肿瘤的生长、转移和复发与其所处的微环境密切相关，而肿瘤相关成纤维细胞（Tumor-associated fibroblasts，TAF）是肿瘤微环境的主要成员，在大多数肿瘤类型的基质组织中分布较多，是肿瘤进展和转移的关键因素［5-6］。放射治疗对肿瘤微环境的毒副作用目前研究较少，放疗后患者体内肿瘤浸润性成纤维细胞的改变尚不明确。鉴于放疗在肿瘤治疗中的广泛应用以及TAF 在癌症发生发展中的重要作用，本研究探讨放疗对TAF 基因表达的影响，通过对Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中电离辐射辐照肺癌患者体内分离的肿瘤浸润性成纤维细胞的芯片数据进行深度分析，鉴定辐照前后肿瘤浸润性成纤维细胞中的差异表达基因及关键信号通路，以期为肺癌放射治疗提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 获取芯片数据

从GEO 数据库中下载辐射处理肿瘤浸润性成纤维细胞基因表达数据集GSE37318用于筛选差异表达基因，该组芯片采用GPL10191 平台，包含8组细胞。从非小细胞肺癌患者体内分离肿瘤浸润性成纤维细胞，进行18 Gy的单剂量辐照，24 h后提取细胞总RNA进行全基因转录组分析。

1.2 鉴定差异表达基因

利用GEO数据库自带软件包GEO2R对芯片数据GSE37318 进行处理，以默认的Benjamini-Hochberg 方法进行统计学分析，以|log2FC|＞1 且adj.p＜0.05 作为筛选标准（FC 为基因表达差异倍数，adj.p为校正后的p值）；利用R 软件中的ggplot2包绘制火山图。

1.3 GO分析和KEGG途径分析

将筛选到的差异表达基因导入DAVID［7］在线工具包进行重注释，并对差异表达基因进行GO和KEGG途径富集分析。

1.4 构建蛋白质相互作用网络

利用STRING 数据库［8］分析差异表达基因的相互作用，利用Cytoscape 3.5.0软件构建蛋白质相互作用网络，并通过插件MCODE筛选和获取核心子模块网络，利用cytoHubba 插件筛选核心基因，以p＜0.05为差异有统计学意义。

1.5 预后价值分析

利用GEPIA［9］在线工具对筛选到的核心基因在肺癌中的预后价值进行LogRank 检验，计算预后相关的风险比（Hazard ratio，HR），以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 辐照后肿瘤浸润性成纤维细胞中的差异表达基因

以|log2FC|＞1 且adj.p＜0.05 作为筛选标准，获得辐照后肿瘤浸润性成纤维细胞表达增加的基因144个（图1），其表达值前10位的基因为CYFIP2、VWCE、NRG1、CES3、TAF7L、BLNK、KCNN4、FDXR、PIDD1和CLCA2。获得表达降低的基因54个（图1），其表达值前10 位的基因为MKI67、DLGAP5、KIFC1、GTSE1、HJURP、CENPA、KNL1、DTL、FAM111B和MCM10。

图1 198个差异表达基因的火山图（彩色见网络版）Fig.1 Volcano plot of 198 differentially expressed genes(color online)

2.2 GO和KEGG途径富集分析

将筛选到的差异表达基因导入DAVID 数据库中进行重注释，并进行GO 和KEGG 途径富集分析。结果表明：下调表达基因主要富集在DNA 复制、链移位、DNA 复制起始和有丝分裂细胞周期的G1/S 转换等生物过程，细胞质、细胞核和染色体着丝粒区域等细胞组份，单链DNA结合、DNA结合和ATP 结合等分子功能，范可尼贫血途径、同源重组和p53等信号通路（图2）；上调表达基因主要富集在DNA 损伤反应、p53 介导细胞周期停滞、细胞增殖正向调控和GTP 酶活性的正向调节等生物学过程，核小体、细胞连接和细胞质等细胞组份，生长因子活动、受体结合和蛋白质异二聚化活性等分子功能，p53信号通路、酗酒、慢性粒细胞白血病、轴突引导和ErbB 信号通路等功能途径（图3）。

图2 下调差异表达基因的GO和KEGG途径分析Fig.2 Gene ontology and KEGG pathway analysis results of down-regulated differentially expressed genes

图3 上调差异表达基因的GO和KEGG分析Fig.3 Gene ontology and KEGG pathway analysis results of up-regulated differentially expressed genes

2.3 蛋白质相互作用网络

将差异表达基因导入STRING数据库分析蛋白质之间的相互作用（Protein-protein interaction，PPI），并利用Cytoscape 3.5.0软件对结果进行可视化，构建了PPI网络，其中包含有103个节点，376条边，如图4所示。

2.4 模块分析

利用Cytoscape 软件的MODE 插件对PPI 网络进行模块分析，筛选核心2 模块，根据打分高低，获得前3个核心模块。模块一包含46个节点和286条边（图5（a）），节点基因对应蛋白分别为HIST1H1C、OGG1、GTSE1、HELLS、MDM2、AEN、 KIAA1524、 MTFR2、 RAD51、 HELB、BRCA2、MCM10、CDC6、SESN1、PCNA、LIG1、HJURP、TCF19、CENPA、HSPA4、BLM、ANAPC2、FBXO5、 HIST1H2AC、 HIST1H2BK、 TMPO、HIST1H2BD、FANCI、DTL、PLK3、CCNE2、NCAPG、 DLGAP5、 KIF15、 BCL2L1、 BRIP1、KIFC1、 CASC5、 MKI67、 PMCH、 DDB2、HIST1H3H、LIN9、CHAF1B、HRAS 和KIF21A。功能主要富集在DNA复制启动、细胞对DNA损伤刺激的反应、基于微管的运动、p53信号途径、同源重组、细胞周期和癌症途径等信号通路（表1）。模块二包含7个节点和11条边（图5（b）），节点基因对应蛋白分别为HIST1H1C、 GREB1、HIST1H3H、SYNE1、HIST1H2AC、HIST1H2BK和HIST1H2BD，功能主要富集在核小体组装、粘膜中先天免疫反应和抗菌体液应答等生物途径（表2）。模块三有11 个节点和23 条边组成（图5（c）），节点基因分别为GAMT、PIDD1、PLK3、CYFIP2、HRAS、SESN1、TP53I3、BBC3、BCL2L1、MDM2和AEN。功能主要富集在有丝分裂细胞周期检查点、细胞对氨基酸刺激的反应、神经细胞凋亡过程的负调节、p53 信号途径和FoxO信号途径（表3）。

图4 蛋白质相互作用网络:红色圆形为上调表达基因编码蛋白；绿色圆形为下调表达基因编码蛋白；线条的粗细表示相互作用强度)(彩色见网络版)Fig.4 Protein-protein interaction network:Red circle：up-regulated proteins；green circle：down-regulated proteins；and the line thickness represents the interaction strength（color online）

表1 模块1的功能富集分析Table 1 Function enrichment analysis of genes in Module 1

图5 蛋白质相互作用网络核心模块分析：（a）模块1；（b）模块2；（c）模块3红色圆圈为上调基因编码蛋白；绿色圆圈为下调基因编码蛋白；连线颜色深浅表示基相互作用的强弱（彩色见网络版）Fig.5 Module analysis of PPI network:（a）module 1;（b）module 2;（c）module 3.Red circle:up-regulated proteins;green circle:down-regulated proteins;the color depth of the line represents the strength of the interaction among genes（color online）

表2 模块2的功能富集分析Table 2 Function enrichment analysis of genes in Module 2

表3 模块3的功能富集分析Table 3 Function enrichment analysis of genes in Module 3

2.5 Hub基因

利用插件CytoHubba 进一步分析构建的PPI 网络，筛选前20 个差异表达的hub 基因，基因间的相互作用网络如图6所示。

图6 蛋白质相互作用网络中的前20个核心蛋白Fig.6 Protein-protein interaction network of the top 20 hub genes

筛选的前20 个基因为NCAPG、MCM10、DTL、DLGAP5、RAD51、CENPA、MKI67、CDC6、FANCI、FBXO5、KIF15、HELLS、HJURP、PCNA、GTSE1、CASC5、CCNE2、CHAF1B、BLM和KIFC1。包含20 个节点和53 条边。这些基因中，仅有PCNA辐照后表达上调，其余基因均表达下调。

2.6 预后价值分析

为了进一步探讨筛选到的核心基因对肺癌的预后价值，我们利用GEPIA 软件结合TCGA 中的数据进行预后价值分析，如图7 所示。前10 个核心 基 因 中 的MCM10（HR=1.5，p=0.005）、DLGAP5（HR=1.5，p＜0.001）、FANCI（HR=1.4，p=0.043）、CENPA（HR=1.6，p=0.002）、CDC6（HR=1.5，p=0.005）、FBXO5（HR=1.6，p=0.003）、NCAPG（HR=1.3，p=0.017）和DTL（HR=1.2，p=0.031）的表达水平均与肺癌的生存时间呈负相关（图7（a）～（h））。

图7 9个核心基因在肺癌病人中的预后价值Fig.7 Prognostic values of 9 genes in lung cancer patients

而辐照处理后这些基因的表达水平均降低，提示辐照可以抑制肺癌发生相关基因的表达，有利于患者的生存。此外，唯一在辐照后高表达的核心基因PCNA的表达水平与肺癌患者的预后呈负相关（HR=1.6，p=0.004）（图7（i）），提示辐照也可在一定程度上促进肿瘤细胞的增殖。

3 讨论

随着核技术、医学影像技术和计算机技术的不断发展，放射治疗技术取得了很大的进步，已成为当前肿瘤综合治疗的主要手段。临床上65%～75%的癌症患者在治疗过程中需要接受放射治疗，约40%的癌症治愈患者将放疗作为其病程管理的重要部分［10］。电离辐射作用于肿瘤细胞：一方面会导致蛋白质、DNA 和RNA 等生物大分子损伤，降低相关基因的表达，促进细胞凋亡、坏死、自噬和衰老，发挥肿瘤杀伤功能；另一方面，肿瘤细胞发生辐射损伤后会启动自身的修复系统，通过调控某些基因的表达，应对辐射损伤，介导肿瘤辐射抵抗，促进肿瘤的复发和转移［11-12］。对这些辐射后的差异表达基因进行分析，既有助于我们理解肿瘤放疗的毒副反应，也可为肿瘤放疗效果、病人预后以及复发转移风险评估提供新的生物标记。

肿瘤微环境是指肿瘤细胞和相邻正常组织之间的区域，其组成主要包括细胞外基质、可溶性分子和肿瘤基质细胞，在肿瘤的细胞免疫逃逸、肿瘤的生长、复发和转移等过程中起着重要作用［13］。TAF 是肿瘤微环境的主要成员，在肺癌等多种肿瘤的进展和转移过程中起着关键作用［14］。鉴于当前放射治疗的大背景下，电离辐射对肿瘤支持性微环境的影响人们知之甚少，本研究利用生物信息学方法，探讨电离辐射处理后TAF 中的差异表达基因及其介导的关键途径，获得了辐照后TAF中的上调表达基因144个，下调表达基因54个。GO和KEGG的分析结果表明，上调表达基因主要富集在DNA 损伤反应、p53 介导细胞周期停滞、细胞增殖正向调控、p53信号通路、慢性粒细胞白血病和ErbB 信号通路等功能途径，而下调表达基因主要富集在DNA 复制、链移位、有丝分裂细胞周期的G1/S 转换、范可尼贫血途径、同源重组、p53等信号通路。电离辐射作用于机体，导致DNA 等生物大分子发生损伤，机体会通过调控一系列基因的表达来启动损伤修复反应，诱导细胞周期停滞，促进DNA 修复，调控细胞增殖［15-16］。当然，高剂量的电离辐射会严重破坏细胞的组织结构，抑制许多功能基因的表达，导致细胞DNA复制及修复缺陷、细胞周期转换障碍和细胞成熟障碍等［17-18］。然而，我们也发现高表达基因所富集的途径也与肿瘤的发生、发展密切相关，如ErbB信号通路的激活与肺癌等肿瘤的侵袭和转移密切相关［19-20］，低表达基因富集的p53信号通路为经典的抑癌通路［21-22］，这些通路的改变很可能是放疗后肿瘤发生复发与转移的重要原因。

我们从PPI网络中获取了Top 20基因，分别为NCAPG、MCM10、DTL、DLGAP5、RAD51、CENPA、MKI67、CDC6、FANCI、FBXO5、KIF15、HELLS、HJURP、PCNA、GTSE1、CASC5、CCNE2、CHAF1B、BLM和KIFC1。这些基因基本都在肿瘤的发生、发展中起着重要作用，NCAPG在前列腺癌和肝癌病人中高表达，并参与促进肿瘤细胞的增殖和迁移，而下调NCAPG的表达可以抑制肿瘤细胞的生长［23-24］。MCM10是介导DNA 复制的重要蛋白，在多种肿瘤细胞和组织中高表达，参与促进肿瘤细胞的增殖［25-26］。DTL是E3 泛素蛋白连接酶的同源物，在肝癌肿瘤组织中高表达，下调DTL的表达可以诱导细胞周期停滞和衰老，抑制肝癌细胞生长和集落形成［27］。PCNA是这Top 20基因中唯一在辐照后表达增高的基因，是DNA聚合酶δ的辅助因子，肺癌等肿瘤中PCNA的表达显著增加，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭［28-29］。此外，这些枢纽基因与肿瘤的预后不良相关，与我们的预后分析结果基本一致，如NCAPG的表达与前列腺癌和肝癌生存期显著负相关［23-24］；MCM10的表达与乳腺癌和前列腺癌患者的不良预后显著相关［25-26］；DTL的表达与乳腺癌和肺癌的预后情况负相关［30］。这些研究结果提示，辐照处理后下调表达的肿瘤相关基因决定了肿瘤放射治疗的效果，而上调表达的基因很可能在后续肿瘤的复发过程中起重要作用。

我们的研究结果表明，电离辐射处理后TAF中的基因表达和生物学途径发生了改变，主要涉及细胞应激、DNA 损伤、细胞周期、衰老、细胞凋亡、氧化应激和基质重塑。电离辐射对TAF 既产生了抗肿瘤效应，也诱导了促肿瘤作用，其具体的作用机制值得我们通过体内实验进一步探讨。