根管治疗失败患者感染微生态研究

杜琛

（阳谷县人民医院口腔科，山东 聊城 252300）

慢性根尖周炎是由根管内长期存在的感染疾病源刺激物而导致的局限于根尖周围组织的慢性炎症，严重影响患者身心健康[1]。根管治疗为治疗慢性根尖周炎的有效手段，可通过清除根管内坏死组织、去除不良刺激，达到缓解疼痛、促进根尖周病变愈合的目的。有研究表明，对于慢性根尖周炎患者，无论是一次性还是多次根管治疗均具有较高的治疗有效率，可达85%以上[2]。但有文献[3]报道，经完整且规范的根管治疗后，仍有4%～15%患者可出现根尖周病变愈合不佳或出现新的根尖病变；同时，有研究表明，根管再治疗2 年后的成功率仅为72%[4]。目前根管内持续感染状态被认为是导致根管治疗失败的主要原因[5]。近年来，研究发现，慢性根尖周炎患者牙根尖外表面存在丰富的根管生物膜结构，而根管治疗后根管生物膜的形成有可能是导致根管治疗失败的主要原因[6]。目前，国内外对根尖周病损组织中菌群构成和优势菌、根尖外表面根管生物膜来源和组成研究较少。基于此，本研究旨在观察未治疗和根管治疗失败慢性根尖周炎患者根尖周病损组织菌群构成和根管内壁及根外生物膜超微结构，以期为临床治疗提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取 2018 年 4 月至 2019 年 4 月本院牙体牙髓科收治的未经治疗和根管治疗失败的慢性根尖周炎患者40例，分为未经治疗组和治疗失败组，各20例。未经治疗组男12例，女8例；年龄24～43 岁，平均年龄（34.14±6.43）岁；单根管14 例，双根管6 例；患牙部位：中切牙12 例，侧切牙8 例。治疗失败组男 13 例，女 7 例；年龄 25～45 岁，平均年龄（34.21±6.48）岁；单根管13 例，双根管7 例；患牙部位：中切牙13 例，侧切牙7 例。两组患者临床资料比较差异无统计学意义，具有可比性。本研究经医院医学伦理会审核批准，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 纳入标准 未经治疗组：年龄18～45 岁；符合牙髓感染所致慢性根尖周炎的诊断标准；X线显示根尖周存在骨质破坏区；不适宜行根管治疗而行拔牙术者。治疗失败组：年龄18～45 岁；符合牙髓感染所致的慢性根尖周炎的诊断标准；经根管治疗后1年，X线显示根尖周仍存在骨质破坏区；未达到根管治疗成功标准。

1.3 排除标准 探诊深度≥3 mm；治疗前3 个月内使用抗生素；既往有根管、牙髓、牙体治疗史；牙颈部以下牙根不完整；牙窦道形成；依从性差。

1.4 方法

1.4.1 样本采集 ①根尖周病损组织：患牙拔除后，利用无菌刮匙刮取牙窝内根尖周病损组织，以无菌的0.9%氯化钠溶液冲洗，置于含1 ml 的TE 缓冲液（北京索莱宝生物科技有限公司，货号：T1120，pH=8.0）的EP管内，-80 ℃保存备用。②根尖片段：患牙拔除后，利用无菌的0.9%氯化钠溶液冲洗患牙及其附着的根尖组织，置于4%中性甲醛组织固定液中，4 ℃保存备用。

1.4.2 根尖周病损组织菌群构成 ①细菌DNA提取：取根尖周病损组织，解冻后加入无菌的0.9%氯化钠溶液，高速混悬1 min，制成细菌混悬液，利用细菌基因组DNA提取试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司，货号：D1600）提取细菌DNA。②PCR扩增：细菌通用引物序列：上游引物27F：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，下游引物1429R：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇，扩增片段长度为1 400 bp。反应体系：细菌基因组DNA模板3 μl，上下游引物各0.5 μl，dNTP 混合液（北京百奥莱博科技有限公司，货号：SV0989）4 μl，10×EX Taq Buffer（北京麦瑞博生物科技有限公司，货号9152A）5 μl，EXTaq酶（北京宝日医生物技术有限公司，货号RR001）0.5 μl，单蒸水36.5 μl，总体积50 μl。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。取PCR扩增产物，置于1%琼脂糖凝胶中电泳，切取1.5 kb目的产物，利用胶回收/DNA纯化试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：DC301）回收和纯化。③16S rDNA克隆文库构建：利用快速DNA连接试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：D7002）将纯化的PCR产物连接至pGEM-T载体（上海泽叶生物科技有限公司，货号：ZY3600）上，连接反应体系：PCR产物2 μl，pGEM-T载体1 μl，单蒸水2 μl，Rapid T4 DNA ligase 5 μl，16 ℃反应2 h。将连接pGEM-T载体的PCR产物克隆至DH5α感受态细胞（北京天根生化科技有限公司，货号：CB101），置于含1.6 pg/mL X-gal、1.8 pg/ml IPTG和50 pg/ml AMP的LB平板培养基（北京天恩泽生物技术有限公司，货号：130848B）中，37 ℃过夜培养；每个平板均采用蓝白斑筛选法随机选取80个白斑，不足80个的以平板中全部白斑计数。④细菌重组质粒测序：由大连宝生物公司完成，引物为27F，单向测序，可疑新菌种或新基因型需加测1429R和907R引物序列；利用Sequencer 4.8软件去除测序峰图的杂峰序列后，截取长度为600 bp的序列，对比GenBank核酸序列数据库，将相似度≥98%定义为基因库菌种相同，记录相似性和分值最高的菌种名称。

1.4.3 根尖片段扫描电镜分析 取根尖片段，利用金刚砂沿牙纵轴打磨一凹槽，凹槽处利用骨凿将牙劈为两等份；任取其中一份，PBS 溶液冲洗3 次，每次5 min，置于1%四氧化锇溶液中，4 ℃固定1 h；PBS溶液冲洗3次，每次5 min，分别置于50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液中浸泡10 min；置于六甲基二硅胺烷溶液中反复浸泡3次，每次10 min；利用全自动临界点干燥仪（德国Leica 公司，型号：EM CPD300）干燥处理，离子溅射仪（北京中科科仪股份有限公司，型号：SBC-12）喷镀后，扫描电镜（日本日立公司，型号：S-4800）下定位根尖孔（低倍镜），选定根管生物膜可疑区域，观察超微结构（高倍镜）。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计数资料以[n（%）]表示，行χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组根尖周病损组织中G+菌和G-菌构成情况比较 两组根尖周病损组织G-菌检出率和克隆比均高于G+菌（P＜0.05）；两组根尖周病损组织G+菌和G-菌检出率和克隆比比较差异无统计学意义，见表1。

表1 两组根尖周病损组织中G+菌和G-菌构成情况比较［n（%）］Table 1 Comparison of composition of G+and G-bacteria in periapical lesions between the two groups[n(%)]

2.2 两组根尖周病损组织中菌种检出情况比较 未经治疗组根尖周病损组织共得到1 478个16S rDNA序列，鉴定出163个菌种，具有较高检出率的菌种从高到低依次为具核梭杆菌（Fusobaeterium nueleatum）、隐蔽小杆菌（Dialister invisus）、纤细弯曲杆菌（Campylobacter gracilis）、轻型链球菌（Streptococcus mitis）；治疗失败组根尖周病损组织共得到1 476个16S rDNA序列，鉴定出103个菌种，具有较高检出率的菌种从高到低依次为粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、惰性嗜血杆菌（Haemophilus segnis）、纤细弯曲杆菌（Campylobacter gracilis）、具核梭杆菌（Fusobaeterium nueleatum）、隐蔽小杆菌（Dialister invisus），见表2。

2.3 两组根管内根管生物膜性状 未经治疗组中，有4 例根尖孔周围见骨质陷窝，陷窝内有根管生物膜存在，主要由球菌组成，其他16 例仅有少量牙骨质吸收，未见根管生物膜形成。治疗失败组中牙根尖外表面均可见不同程度的牙骨质吸收，根管内壁有呈间断岛状或分布连续片状分布的根管生物膜存在，主要由球菌或杆菌组成，见图1。

图1 两组根管内根管生物膜性状扫描电镜分析Figure 1 Analysis of biomebrane characters by scanning electron microscope

3 讨论

根管治疗是治疗慢性根尖周炎的有效手段之一[7]。研究表明，根管治疗可使牙髓和根尖周类疾病患者获得较好的近远期疗效[8]。但有文献[9]报道，经反复多次常规根管治疗后，仍有4%～15%的病例无法彻底清除根尖周病变，表现为复发性根尖周脓肿和进行性骨质破坏，严重者可致牙槽骨缺损和牙丧失，严重影响患者的生活质量。有研究表明，未经治疗和根管治疗失败的慢性根尖周炎根管内细菌菌丛存在明显差异，不同种属细菌的联合作用可能是导致根管治疗失败的主要原因[10]。生物膜是细菌生存的主要环境，不仅可为细菌生长繁殖提供物质基础，还可增加其致病作用[11]。近年来，研究发现，根管治疗后的患牙可因无血供形成根管生物膜，根管生物膜耐药性较强且抵抗宿主免疫进攻能力较好，可影响根管治疗效果[12]。

研究表明，持续性根尖周炎存在根管外感染，部位包括根尖生物膜和根尖周组织[13]。本研究结果显示，两组根尖周病损组织G-菌检出率和克隆比均高于G+菌，提示未经治疗和根管治疗失败患者根尖周病损组织细菌定植均以G-为主，与以往研究结果一致[14]。进一步分析发现，两组在优势菌构成上存在一定差异，未经治疗组根尖周病损组织具有较高检出率的菌种从高到低依次为具核梭杆菌、隐蔽小杆菌、纤细弯曲杆菌、轻型链球菌，与黄燕华等[10]报道的根尖周炎根管尖段细菌检出率从高到低依次为中间普氏菌、牙髓卟啉单胞菌、具核梭杆菌和粪肠球菌的结果类似。治疗失败组根尖周病损组织具有较高检出率的菌种从高到低依次为粪肠球菌、惰性嗜血杆菌、纤细弯曲杆菌、具核梭杆菌、隐蔽小杆菌，与黄燕华等[10]报道的根管治疗失败根管细菌以粪肠球菌为主且集中在根管尖段的结果一致，与周焱等[14]报道的嗜血杆菌属根管治疗失败持续性感染中可能发挥重要作用的结果不一致，可能与检测的样本来源不同有关；同时，李莹雪等[15]研究发现，粪肠球菌在根管治疗后持续或继发性感染根管中具有较高的检出率，与根管治疗失败密切相关。根管生物膜是附着于根管内壁的生物膜。研究显示，未经治疗和根管治疗失败的慢性根尖周炎患者根管壁中均能检出根管生物膜，但结构和组成存在一定差异[16]。本研究结果显示，未治疗和治疗失败的慢性根尖周炎患者根管壁中均能检出根管生物膜，未经治疗样本的牙根外表面以球菌组成的膜状结构为主，而治疗失败样本的牙根外表面以球菌或杆菌组成的网状或层叠装的半封闭或完全封闭结构为主，提示与未治疗的慢性根尖周炎比较，根管治疗失败的根尖生物膜结构多样且致密。

综上所述，以粪肠球菌为主的细菌定植和根尖外表面根管生物膜的形成可能是导致慢性根尖周炎患者根管治疗失败的主要原因。