结核感染T细胞斑点试验在结核性胸膜炎诊断中的价值

赵忠勤

（辽宁省抚顺市第四医院结核二病房，辽宁 抚顺 113123）

结核性胸膜炎是一种肺外结核病，在我国被列为结核病的第四类型，是引起患者胸腔积液的主要原因，占比可达49.5%～54.5%[1]。结核性胸膜炎没有特异性的临床表现，增大了诊断的难度。目前在为结核性胸膜炎患者实施很短的过程中，最为主要的诊断参考依据有：胸腔积液的常规检查、影像学表现、临床表现、病史问询等，并要结合临床治疗效果实施判断，通过这种常规的诊断方式，其诊断准确率是比较低的，难以将其与恶性胸腔积液予以良好的鉴别，很容易导致出现误诊，从而引发严重后果。随着各项技术的进步与发展，在结核性胸膜炎的临床诊断工作中，逐渐引进了病理学检查与细菌学检查，随着一段时间的研究与发展，这意见逐渐发展成为结核性胸膜炎诊断的金标准，但是在实际的临床应用中，结核性胸腔积液当中所包含的细菌含量是比较小的，胸腔积液中结核菌培养及涂片分枝杆菌阳性率是比较低的，再加上胸腔积液中结核分枝杆菌的培养时间比较长，通过胸腔镜取病理检查或者是胸膜活检的方式检查出的阳性率是比较高的，但是这都是有创的检查方式，很难在临床上大规模的常规应用。随着分子生物学技术及免疫学技术的进一步发展，其在大规模筛查中的适用性越来越高，并且具有快速、简便的特点，但是还是存在操作不当影响检查结果、假阳性等缺陷，这导致其在结核性胸膜炎诊断中的应用存在一定的局限性，探究一种新型的检测技术，促使结核性胸膜炎诊断准确性的提升具有非常重要的意义。为了提高诊断的准确率，以本院2015年11月～2017年11月收治的55例结核性胸膜炎的患者为研究对象，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 研究对象选为2015年11月～2017年11月于本院接受诊治的结核性胸膜炎患者、恶性胸腔积液患者、非结核性胸膜炎患者和健康志愿者各55例，所选患者均无合并其他严重的器官性疾病和精神疾病等。结核性胸膜炎组有男28例和女27例，年龄20～70岁，平均（42.8±13.5）岁；恶性胸腔积液组有男29例和女26例，年龄24～68岁，平均（43.5±11.8）岁；非结核性胸膜炎组有男27例和女28例，年龄22～69岁，平均（43.0±11.4）岁；健康志愿者组有男28例和女27例，年龄22～70岁，平均（43.7±11.2）岁。对4组患者的临床资料进行比较差异无统计学意义，具有可比性。1.2 方法 采集被检者的外周静脉血4 ml，放置于抗凝试管中，加入一定量的肝素锂并使其混合均匀，在4小时内完成外周血单个核细胞（PBMC）的分离，具体操作如下：取一个离心管，记为1号，注入4 ml RPMI1640培养液，将混合均匀的4 ml抗凝血液样本导入此离心管中，使二者均匀混合。再取一个离心管，记为2号，注入淋巴细胞分离液3 ml，将先前完成混合的血压样本缓慢倒入2号离心管中淋巴细胞分离液的上方，然后置于离心机中进行离心操作，时间设置在20 min左右，离心完成后用加样器吸取白细胞层，放入一个15 ml的离心管中，记为3号，再加入RPMI1640培养液11 ml，离心7 min，待沉淀完全后取分离出的上清液于离心管4号，加入一定量的无血清培养液，即AIMV，配置细胞工作液。

以细胞工作液进行结核感染T细胞斑点试验：在板条上制4孔，分别加入50μl的AIMV、抗原A（ESAT-6：结核分枝杆菌早期分泌靶向抗原6）、抗原B（CFP-10：培养滤液蛋白10）和阳性对照[2]，在每个孔中均加入100μl的细胞工作液。将板条放置入CO2培养箱中进行16～20 h的温育，箱内温度维持在37℃，CO2浓度为5%。温育时间到达后，取出板条，倒出孔中液体，使用磷酸盐缓冲液冲洗4次后，于每孔加入碱性磷酸酶标记过的小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体50μl，再次置于CO2培养箱中进行1 h的温育，箱内温度设定在4～8℃，板条取出后再次用磷酸盐缓冲液冲洗4次。冲洗过后，加入50μl的显色底物，置于培养箱中在暗处、室温下温育7 min，取出板条后用自来水冲洗，晾干，2～3 h后读取结果。

1.3 观察指标 比较4组被检者的阳性率，以T-SPOT.TB试剂盒的使用说明书为所测血液样本结果的判定依据，阳性：血液样本的阴性对照孔斑点形成细胞（SFC）小于6，且（检测孔SFC-阴性对照孔SFC）×4的计算值不小于24；阴性：血液样本的阴性对照孔SFC不小于6，且检测孔SFC为阴性对照孔SFC的2倍。

1.4 统计学方法 本研究数据均用SPSS 19.0统计软件处理，计数资料用例数（n）表示，计数资料组间率（%）的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

以ESAT-6抗原、CFP-10抗原作为刺激物时，结核性胸膜炎组的阳性率大幅超出恶性胸腔积液组、非结核性胸膜炎组和健康志愿者，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。ESAT-6/CFP-10联合2种抗原检测的阳性率显著高于单种抗原检测的阳性率，对比差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 4组被检者的测试结果统计情况[n（%）]Table 1 4 Statistics of test results for 4 groups of subjects[n(%)]

3 讨论

胸膜炎是致病因子侵犯人体的胸膜引起炎症的疾病，可分为10种类型，结核性胸膜炎是最为常见的一种，是结核杆菌及其自溶产物、代谢产物进入机体的胸膜腔而引发的[3-4]。结核性胸膜炎患者的临床表现不存在特异性，难以根据临床症状来确诊。临床上将在胸腔积液中检查到抗酸杆菌和结核分枝杆菌培养阳性作为诊断的金标准，如果利用细菌学方法诊断，检测的阳性率很低；胸膜活检的准确性高，但是对患者的创伤很大[5-6]。因此，临床上需要一种无创微创、检测阳性率高的方式来进行早期诊断。

本研究中使用的结核感染T细胞斑点试验是在酶联免疫斑点技术的基础上发展而来的，检测原理是基于结核分枝杆菌的基因中存在着“RD1”的序列，该序列编码能产生两种蛋白，分别是本研究中使用的ESAT-6和CFP-10，以这两种蛋白作为特异性抗原，能将机体中的T淋巴细胞刺激成为致敏T淋巴细胞，并分泌出IFN-γ细胞因子[7-8]；结核感染T细胞斑点试验能够从单细胞水平检测到分泌抗体细胞或者是分泌细胞因子细胞，每个显色斑点均代表着一个结核分枝杆菌致敏的T淋巴细胞，因此，通过斑点的数目即可判定机体内是否存在着致敏T淋巴细胞，并可计算数目，从而可知是否存在着结核分枝杆菌[9]。从研究结果来看，结核性胸膜炎组结核感染T细胞斑点试验的阳性检出率高达85.5%和78.2%，联合使用ESAT-6和CFP-10的话，可将阳性率大幅提高至92.7%。已有的研究结果指出，效应T淋巴细胞的存活期是非常短的，一般在病原体被消灭之后就会消失，所以临床上对外周血结核感染T细胞斑点试验结果来进行评估，也能够对患者的临床疗效评估及病情活动性的监测提供一定的参考依据。结核感染T细胞斑点试验出现假阴性或者是假阳性的概率也是非常低的，出现假阴性可能与在细胞免疫发生前获取了标本存在一定的关联性，有时也会因为少数免疫系统功能的不健全导致其值与临界值接近，对于这种情况，对所选取的参考值应仔细考量、慎重选择，综合的考虑其他辅助检查结果及患者的临床表现来进行进一步的判断，对于假阳性的出现，可能与患者曾今有过结核分枝杆菌潜伏性感染存在一定的关联性[10]。与传统的酶联免疫法相比，结核感染T细胞斑点试验应用于结核性胸膜炎患者临床诊断中的稳定性更高，但是实验人员操作手法等外在因素也会对试验结果产生影响，并且在温度环境比较低的情况下，环境中的效应T淋巴数量会有所减少，若是将获取的胸水长时间放置，会导致其T淋巴数量逐渐减少，甚至是消失，因此，临床诊断过程中，送检的胸水必须是新鲜采集的。

综上所述，核感染T细胞斑点试验用于结核性胸膜炎的诊断有较高的准确率，操作简单，建议临床采纳和推广。