叶酸代谢酶基因多态性与反复自然性流产易感性的研究

李晓英 陈丽娟 郭惠萍 强萍

叶酸代谢酶基因多态性与反复自然性流产易感性的研究

李晓英 陈丽娟 郭惠萍 强萍

目的 探讨叶酸代谢酶关键酶基因多态性与反复自然性流产的易感性。方法 采用基因测序技术检测60例反复自然性流产和150例正常妊娠的妇女亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR C 677 T、A 1298 C和甲硫氨酸合酶还原酶MTRR A 66 G的基因多态性。结果 流产组MTHFR C 677 T等位基因频率中T所占比率30.0%（36/120）明显高于对照组21.3%（64/300）（P＜0.05）；自然性流产组MTHFR A 1298 C基因型频率中CC所占比率13.3%（8/60）高于对照组3.3%（5/150）（P＜0.05）；等位基因频率中C所占比率35.8%（43/120）明显高于对照组24.7%（74/300）（P＜0.05）；MTRR A 66 G基因等位基因频率中G所占比率33.3%（40/120）明显高于对照组25.3%（76/300）（P＜0.05）。结论 与正常妊娠的妇女比较，反复自然性流产妇女的MTHFR基因A 1298 C、C677 T两个位点和MTRR A66 G位点基因的突变基因频率明显增加，MTHFR基因和MTRR基因的多态性的检测可作为反复自然流产患者的临床诊断指标。

反复自然流产；亚甲基四氢叶酸还原酶；蛋氨酸合成酶还原酶；多态性；易感性

反复自然性流产是指连续发生2次或2次以上的自然流产，是妊娠期常见并发症之一，发病率为1%～2%，占所有妊娠丢失的15%～20%[1]。目前研究发现，胎盘动脉栓塞所致的胚胎血供不足、绒毛坏死是自然习惯性流产发生的重要原因之一，而高同型半胱氨酸血症是血液高凝状态及相关疾病的的独立危险因素[2-4]。高同型半胱氨酸代谢相关酶基因突变是导致叶酸代谢障碍和高同型半胱氨酸血症的遗传性因素，因此，很多学者都将焦点集中在影响叶酸及同型半胱氨酸的代谢、转运的基因上。研究表明，亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate，MTHFR)及甲硫氨酸合酶还原酶(Methionine synthase reductase，MTRR)基因存在多种基因多态性位点，其中最常见的是MTHFR基因的C 677 T、A 1298 C和MT RR的A 66 G[5]，而这些基因的突变与血清中叶酸、维生素B12及血同型半胱氨酸水平关系密切[6]。本研究旨在探讨MTHFR C 677 T、A 1298 C和MTRR A 66 G基因与反复自然性流产的易感性进行。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年5月～2015年5月张家港市第一人民医院收治的反复自然性流产非孕期患者60例为本次研究对象。其中，年龄20～36岁，平均年龄（25.3±3.5）岁。所有患者诊断标准符合第8版《妇产科学》[7]有关反复自然性流产的诊断。同时选择同期150例正常妊娠的妇女作为对照，年龄21～35岁，平均年龄（23.2±4.1）岁。

1.2 方法

1.2.1 试剂与设备 采用Ta q m a n-M G B技术对MTHFR基因C 677 T、A 1298 C和MTRR基因A 66 G位点的单核甘酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）分型进行检测。相关仪器、试剂均购自美国ABI公司。反应所用的基因多态位点引物信息见表1。

表1 反应所用的基因多态位点引物信息

1.2.2 样本DNA提取及叶酸基因分型 样本DNA采集：提取受检者的口腔黏膜上皮细胞，利用柱式抽提试剂盒抽提样本DNA。采用基因测序技术，检测MTHFR C 677 T、MTHFR A 1298 C和MTRR A 66 G的基因多态性。

1.3 统计学方法 采用统计学SPSS 17.0软件进行数据处理，计数资料用例数（n）表示，计数资料组间率（%）的比较采用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTHFR C 677 T基因型频率和等位基因频率 自然性流产组MTHFR C 677 T基因型频率中CT、TT、CC所占比率与对照组比较，差异无统计学意义；等位基因频率中T所占比率明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 2组MTHFR C 677 T基因型频率和等位基因频率分布情况［n（%）］

2.2 MTHFR A 1298 C基因型频率和等位基因频率 自然性流产组MTHFR A 1298 C基因型频率中AA、AC所占比率与对照组比较差异无统计学意义，CC所占比率稍高于对照组（P＜0.05）；等位基因频率中C所占比率明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 2组MT HFR A 1298 C基因型频率和等位基因频率分布情况［n（%）］

2.3 MTRR A 66 G基因型频率和等位基因频率 自然性流产组MTRR A 66 G基因型频率中AG、GG所占比率、AA所占比率与对照组比较差异无统计学意义；等位基因频率中G所占比率明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 2组MT RR A 66 G基因型频率和等位基因频率分布情况［n（%）］

3 讨论

叶酸是同型半胱氨酸代谢途径的一个重要物质，叶酸代谢途径的正常运转在维持DNA正常甲基化和DNA从头合成以及DNA修复中是至关重要的[8]。若控制叶酸代谢的关键酶基因突变，其活性将显著降低，直接影响DNA低甲基化，导致染色体畸变[9]。早在1990年国外学者Libbus等就报道了对仓鼠卵培养中发现缺乏叶酸的培养组的仓鼠染色体畸变率(包括染色体裂隙、染色体断裂等)是正常仓鼠的10倍[10]。其原因为血浆中有缺陷的叶酸代谢可能会导致DNA合成、参与胚胎形成过程中DNA甲基化受损。且如果体内叶酸缺乏，5-甲基四氢叶酸生成减少，同型半胱氨酸复甲基化通路受阻，体内同型半胱氨酸水平也蓄积升高。所以，出生的缺陷的发生不仅与叶酸缺乏有关，还与同型半胱氨酸升高密切相关。

MTHFR和MTRR是叶酸转运和代谢过程中关键的酶，这些酶基因多态性是过去十多年来的研究热点，与先兆子痫、胎儿生长受限、死胎、唇腭裂、反复自然流产、胎儿畸形发生等不良孕产结局有关[11-13]。MT HFR基因包括10个内含子和11个外显子，位于1号染色体短臂，现已发现近二十种基因多态性突变位点，其中以A 1298 C、C 677 T两个位点的研究最多而备受关注。MTHFR第7个外显子1298位点腺嘌呤A被胞嘧啶C替代，表现为3种基因型：AA、AC、CC，使得编码谷氨酰胺转变为丙氨酸，使酶的活性降低。MT HFR 677位点胞嘧啶C突变成胸腺嘧啶T，表现为三种基因型：CC、CT、TT，基因突变导致在相应位置上MTHFR表达产物发生了改变，由缬氨酸代替了丙氨酸，使酶的活性降低。MT RR基因包括14个内含子和15个外显子，位于5号染色体短臂，常见的为A 66 G的多态性。MT RR 66位点位于第2外显子，位点腺嘌呤A突变成鸟嘌呤G后，可引起编码氨基酸由异亮氨酸变为蛋氨酸。这3个基因多态性位点的基因突变导致叶酸代谢酶活力下降，将导致血浆叶酸和维生素B 12水平降低，血浆同型半胱氨酸水平上升。

冯玲等[14]通过研究叶酸代谢相关基因的多态性与唐氏综合征的发生关系发现，MTHFR C 677 T突变型等位基因(T)频率，MTRR A 66 G突变型等位基因(G)频率在实验组和对照组差异有统计学意义，CC、TT、GG基因型频率分布差异有统计学意义(P＜0.05)。MTHFR C 677 T、T 677 T基因型、MTRR G 66 G基因型增加了唐氏综合征的发生风险，MT HFR C 677 C基因型可能是降低唐氏综合征发生的保护性因素。Chedraui等[15-16]于2014、2015年2篇研究MTHFR A 1298 C、C 677 T与先兆子痫的发生关系的论文指出，发现携带1298 CC纯合子突变型和C 677 T多态性的TT突变基因型的孕妇更容易发生先兆子痫。刘念等[17]研究认为，不良孕产的发生与其MTHFR基因C 677 T、A 1298 C位点和MTRR基因A 66 G位点的突变纯合型基因频率的增加有关。本研究结果显示，自然性流产组MTHFR A 1298 C基因型频率中CC所占比率高于对照组（P＜0.05）；等位基因频率中C所占比率明显高于对照组（P＜0.05）；流产组MTHFR C 677 T等位基因频率中T所占比率明显高于对照组（P＜0.05）；MTRR A 66 G基因等位基因频率中G所占比率明显高于对照组（P＜0.05），说明MTHFR基因A 1298 C、C 677 T两个位点和MTRR A 66 G位点基因的突变基因频率增加与自然性流产有关。分析其原因为叶酸转运和代谢过程中关键的酶MTHFR及MTRR酶位点基因的突变基因频率增加，导致MTHFR及MTRR酶活性的作用降低，引起血浆高同型半胱氨酸和低叶酸水平，造成同型半胱氨酸在体内蓄积，从而导致自然流产和胚胎发育异常等不良孕产的结局[18]。

总之，与正常妊娠的妇女比较，反复自然性流产妇女的MTHFR基因A 1298 C、C 677 T两个位点和MTRR A 66 G位点基因的突变基因频率明显增加，MTHFR基因和MTRR基因的多态性的检测可作为反复自然流产患者的临床诊断指标。

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Objective To investigate the susceptibility between a key enzyme in folate metabolism enzyme and recurrent spontaneous abortion. Methods The genetic polymorphisms of MTHFR C 677 T, MTHFR A 1298 C and MT RR A 66 G in 60 cases of recurrent spontaneous abortion and 150 normal pregnant women were detected using gene sequencing technology. Results MTHFR C 677 T T allele frequency in percentage in natural abortion group 30.0% (36/120) was significantly higher than that in the control group 21.3% (64/300) (P ＜0.05); MTHFR A 1298 C CC genotype frequency percentage in natural abortion group 13.3% (8/60) was higher than that in the control group 3.3% (5/150) (P ＜0.05); C allele frequency percentage 35.8% (43/120) was significantly higher than that in the control group 24.7% (74/300) (P ＜0.05); MTRR A 66 G Allelism G gene frequency percentage in natural abortion group 33.3% (40/120) was significantly higher than that in the control group 25.3% (76/300) (P ＜0.05). Conclusion Compared with normal pregnancy women, MTHFR gene A 1298 C, C 677 T and MTRR A 66 G frequency increased in recurrent spontaneous abortion patients, it can be as recurrent spontaneous abortion patients with clinical diagnostic criteria.

Recurrent spontaneous abortion; Methylenetetrahydrofolate reductase; Methionine synthase reductase; Polymorphism; Susceptibility

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.33.001

江苏 215600 张家港市第一人民医院 （李晓英 陈丽娟 郭惠萍 强萍）

陈丽娟 E-mail：zhangying 0308@126.com