TRPV1基因的shRNA逆转录病毒载体的构建和鉴定

琚幼婷 卢俊 胡衍辉 陈受琳 蔡俊赢 李昌

TRPV1基因的shRNA逆转录病毒载体的构建和鉴定

琚幼婷 卢俊 胡衍辉 陈受琳 蔡俊赢 李昌

目的 构建针对人瞬态电压感受器阳离子通道，子类V，成员1(TRPV1)基因的pSUPERretro-puro TRPV1逆转录病毒表达载体，感染U87-MG细胞，观测其沉默TRPV1基因的效果。方法 利用Ambion在线设计软件设计针对人TRPV1基因的shRNA干扰序列，克隆到pSUPERretro-puro载体上。对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析。用磷酸钙法制备pSUPERretro-puro TRPV1逆转录病毒，将其感染到U87-MG细胞，经嘌呤酶素筛选阳性克隆后采用荧光定量PCR及Western blotting法检测TRPV1表达。结果 经DNA测序和酶切鉴定表明，pSUPERretro-puro TRPV1表达载体构建成功。pSUPERretropuro TRPV1逆转录病毒感染U87-MG细胞后，细胞中TRPV1表达量明显降低。结论 成功构建了针对人TRPV1基因的pSUPERretro-puro TRPV1表达载体。pSUPERretro-puro TRPV1能有效下调TRPV1基因在U87-MG细胞中的表达，为将来应用其研究TRPV1在利多卡因致细胞损伤中的作用奠定了基础。

瞬态电压感受器阳离子通道；利多卡因；逆转录病毒

瞬态电压感受器阳离子通道蛋白（transient receptor potential ion channel protein,TRP）是细胞膜或细胞器膜上的一类非选择性阳离子通道蛋白。TRP基因家族编码的蛋白质广泛分布于哺乳动物中。TRP亚类TRPV1是由TRPV1基因编码的蛋白质[1]。1997年，Caterina等成功克隆了TRPV1受体，它由432个氨基酸组成，可以被辣椒素和其他炎性介质激活，因而也称为辣椒素受体。激活TRPV1通道蛋白可使细胞内钙离子浓度增高从而激活下游的钙依赖性蛋白激酶，从而调节相应的生理功能或介导病理性损伤[2-5]。有研究报道活化的TRPV1可使痛觉感受增强，而TRPV1基因缺失小鼠在炎性介质处理后对热刺激敏感性未见增高，提示TRPV1在痛觉敏感性增强的病理过程中起重要作用[6-7]。局麻药引起的神经毒性损伤常导致病理性疼痛。Leffler等证实利多卡因作用于TRPV1的辣椒素结合位点并激活TRPV1，使脊髓背根神经节细胞内钙离子浓度升高并导致兴奋性氨基酸释放[8-9]，而细胞内钙超载和兴奋性氨基酸过度释放参与了神经细胞的损伤过程。因此，TRPV1的持续激活可能与利多卡因引起的神经毒性损伤有关。RNA干扰技术（RNAi）可特异地下调靶基因表达，是一种简便的研究基因功能的方法。目前未见有针对人TRPV1基因shRNA干扰载体方面的报道。本研究构建了人TRPV1基因的重组逆转录病毒pSUPERretro-puro TRPV1，并在U87-MG细胞中建立TRPV1低表达细胞株，为进一步研究TRPV1在局麻药神经毒性损伤机制中的作用提供基础。

1 材料与方法

1.1 一般材料 Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ限制性内切酶，T4连接酶（日本Takara公司）；去内毒素质粒提取试剂盒，Taq酶和逆转录试剂盒（美国Promega公司）；DMEM培养基、胎牛血清、Trizol、Polybrene（美国Sigma公司）；U87-MG细胞株（上海生物科技有限公司）；兔抗人TRPV1抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体（北京博奥森生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 s i R N A靶序列设计 根据TR P V 1基因序列（NCBI登录号为NM_080704）及shRNA设计原则，使Ambion公司设计软件(http：//www.ambion.com/ techlib/misc/siRNA_finder.Html)，设计针对TRPV1基因编码区序列中的3段序列（1574～1594，1004～1024，2815～2835）。序列如下：(1)Sense：5'GATCCCCGCATCTT CTACTTCAACTTCCTTCAAGAGAGGAAGTTGAAGT AGAAGATGCTTTTT 3’Anti-sense：5’AGCTTAAAAA GCATCTTCTACTTCAACTTCCTCTCTTGAAGGAAGT TGAAGTAGAAGATGCGGG 3’(2)Sense：5’GATCCCCG CCTGGAGCTGTTCAAGTTCATTCAAGAGATGAACT TGAACAGCTCCAGGCTTTTT 3’Anti-sense：5’AGCT TAAAAAGCCTGGAGCTGTTCAAGTTCATCTCTTGA ATGAACTTGAACAGCTCCAGGC GGG3’(3)Sense：5’G ATCCCCGCAGACAGCACTGTCAACACTTTCAAGAG AAGTGTTGACAGTGCTGTCTGCTTTTT3’Anti-sense：5’CTTAAAAAGCAGACAGCACTGTCAACACTTCTCTTGAAAGTGTTGACAGTGCTGTCTGCGGG3’划线部分为TRPV1特异性序列。所有序列经使用BLAST和相应的人基因组数据库进行比较，排除同源性后提交Invitrogen公司合成。

1.2.2 构建pSUPERretro-puro TRPV1表达载体化学合成siRNA的正义链和反义链后，分别取5μL正、反义寡核苷酸(终浓度均为10μmol/L)，5μL10×退火缓冲液，加入35μL去离子水，在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃ 5 min，85℃ 5 min，75℃ 5 min，70℃ 5 min，4℃保存。退火处理后得到浓度为10μM的shRNA模板。将所得模板溶液稀释500倍，终浓度为20 nM，用于连接反应。将退火后的双链siRNA模板和pSUPERretro-puro载体于16℃连接过夜。用连接产物转化菌种是STBL3，在氨苄青霉素抗性平板上筛选重组质粒载体，扩增抗性菌落并提取质粒，将酶切鉴定初步鉴定的阳性克隆送于华大基因公司测序，测序显示目的片断正确插入pSUPERretro-puro表达载体中。

1.2.3 制备逆转录病毒和建立稳定转染细胞 pSUPERretropuro TRPV1逆转录病毒表达载体和PIK包装质粒以磷酸钙共沉淀法转染293 T细胞，24 h后收集含病毒上清液的培养基。将对数期U87-MG细胞传代，24 h后开始感染，弃掉待感染细胞的培养基，加入5 mL病毒液，并加入poly-brane，每4 h重复感染1次，共感染4次。感染结束后加入嘌呤霉素筛选阳性克隆。

1.2.4 荧光定量PCR检测TRPV1表达 设计PCR引物（由Invitrogen公司合成），序列如下：

F：5'AGCTACTACAAGGGCCAGACAG3’

R：5'CTGCAGCAGGAACTTCACGAT3’

提取总RNA后进行逆转录反应，并将产物进行荧光定量PCR扩增和检测。反应体系为20μL，其中2×Mix SYBR Green I荧光反应液10μL，上下游引物各0.25μL，样品模板1μL，用灭菌水补足20μL体系。反应条件95℃ 2 min预变性，循环内95℃ 30 s变性，60℃退火35 s，PCR反应设置40个循环，并在每个循环延伸末端点收集荧光信号，绘制扩增曲线；40个循环后设置反应（95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃15 s），并且对60℃～95℃升温过程进行荧光信号收集，绘制融解曲线。

1.2.5 Western blotting检测TRPV1表达 将转染后的细胞用IP裂解液加1%的PMSF蛋白酶抑制剂来裂解蛋白，用BCA法测量蛋白浓度；用12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，恒压100 V转膜1 h，经抗体孵育后显色。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料采用“x±s”表示，组间比较采用t检验。光密度值采用完全随机单因素方差分析，组间比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒的鉴定 DNA序列测定结果表明，各序列已成功插入了质粒载体。见图1。重组质粒分别命名为pSUPERretropuro TRPV1(1)，pSUPERretro-puro TRPV1(2)，pSUPERretropuro TRPV1(3)。重组载体shRNA编码序列与设计的片段完全一致，表明载体构建正确。

图1 重组载体测序鉴定

2.2 荧光定量PCR检测转染细胞TRPV1 mRNA的表达荧光定量PCR结果显示空载逆转录病毒对照组细胞TRPV1表达相对较高，而pSUPERretro-puro TRPV1(1)、(2)和(3)均能抑制TRPV1 mRNA表达，其中pSUPERretro-puro TRPV1(1)干扰效果最明显(P＜0.05)。见图2。

图2 检测TRPV1 mRNA的表达水平注：1.对照组；2.pSUPERretro-puro TRPV1(1)组；3.pSUPERretro-puro TRPV1(2)组；4.pSUPERretro-puro TRPV1(3)组；与其它组相比，*P＜0.05

2.3 Western blotting检测转染细胞TRPV1蛋白的表达 Western blotting检测显示pSUPERretro-puro TRPV1(1)组TRPV1蛋白表达水平明显低于pSUPERretropuro TRPV1(2)、(3)组和空载逆转录病毒对照组(P＜0.05)，证明pSUPERretro-puro TRPV1(1)载体可有效抑制TRPV1蛋白在细胞中的表达。见图3、图4。

图3 Western blotting检测各组TRPV1蛋白表达水平注：1.对照组；2.pSUPERretro-puro TRPV1(1)组；3.pSUPERretro-puro TRPV1(2)组;4.pSUPERretro-puro TRPV1(3)组

图4 各条带的吸光度值注：1.对照组；2.pSUPERretro-puro TRPV1(1)组；3.pSUPERretro-puro TRPV1(2)组；4.pSUPERretro-puro TRPV1(3)组；与其它组相比，*P＜0.05

3 讨论

TRP是一类分布广泛的阳离子通道蛋白，有超过30个TRP通道家族成员在哺乳动物中先后被克隆。TRPV1是TRPV亚家族第一个被克隆的通道蛋白，其主要表达在背根神经节和三叉神经的神经元中，主要功能是感受伤害性刺激[10-12]。辣椒素分子结构中具有香草醛的类似结构即4-羟基-3-甲氧苯甲基，因此

TRPV1又被称为香草酸受体亚型1。TRPV1除对辣椒素敏感外，还可被多种因素如花生四烯酸代谢产物、前列腺素、脂质过氧化物、细胞外渗透压的改变、热刺激和静电荷等激活[13-14]。TRPV1激活时可导致钙、钠、镁等阳离子内流，但对钙离子有相对选择特异性。TRPV1最初在疼痛领域受到关注，逐渐得到深入研究。Bolcskei[15]等将佛波醇注入小鼠脚掌，观察到TRPV1基因敲除小鼠不出现痛觉反应。Hudenl[16]等研究发现，周围神经结扎引起神经源性疼痛导致背根神经节TRPV1表达增加。有研究发现，TRPV1基因敲除小鼠对炎性刺激因子和热刺激痛敏有明显的抑制作用，但对化学致痛物质仍表现敏感。而有学者认为TRPV1参与了

TNF-α炎症反应过程[17]。对糖尿病神经病性疼痛的研究结果也表明TRPV1参与了神经源性炎症[18]。这些研究表明，TRPV1通道蛋白在钙离子内流和病理性疼痛的发生中起重要作用。

局麻药神经毒性反应可引起病理性疼痛和运动功能障碍等神经症状，其具体机制尚不完全清楚。细胞内钙超载可能是局麻药导致神经细胞凋亡的机制之一[19-20]。研究发现，利多卡因引起细胞内钙离子浓度增加，钙离子可能通过电压依赖型钙通道进入细胞内，使细胞内钙离子浓度增高并可通过钙诱导的钙释放（calcium induced calcium release，CICR）机制导致钙超载（即细胞外钙离子进入细胞后，诱发细胞内钙库释放大量的钙离子，使细胞内钙离子浓度骤升，造成钙超载）[21]。钙超载可通过激活钙依赖性蛋白酶，促进氧自由基增多，介导细胞凋亡[22]。有研究证实利多卡因作用于TRPV1的辣椒素结合位点并激活TRPV1，使脊髓背根神经节细胞内钙离子浓度增高。综上所述可以推测，利多卡因可能通过激活TRPV1通道蛋白引起细胞内钙离子浓度增高，通过CICR机制导致细胞内钙超载。

Puljak[23]等在大鼠脊髓处注射2.0%利多卡因，观察大鼠对疼痛的反应并分离背根神经节，结果大鼠出现痛觉过敏，并发现神经细胞炎症反应。有研究[24]提示利多卡因可抑制中性粒细胞凋亡，并可上调促炎因子S100A8/9、CRAMP/LL-37的表达，下调抗炎因子IL-4、IL-13和Galectin-1的表达，通过促进炎症反应导致神经细胞损伤。TRPV1主要参与神经组织炎症过程，而利多卡因的促炎症反应是否与TRPV1通道蛋白有关还需进一步研究。

通过RNAi技术使基因沉默主要有2种方式，一种是直接利用合成的siRNA作用于细胞产生抑制效应，另一种是在细胞内表达具有茎环结构的shRNA使细胞内Dicer系统激活从而产生效应，因此shRNA分子可以长时间干扰目的基因表达。逆转录病毒载体可有效转染细胞并整合至基因组中，有利于长期稳定表达目的基因片断。本研究采用pSUPERretro-puro逆转录病毒载体，将针对TRPV1的shRNA片断插入载体的H1 RNA启动子后面，构建了3个pSUPERretro-puro TRPV1载体，通过转染U87-MG细胞并经荧光定量PCR和Western blotting检测证实pSUPERretro-puro TRPV1(1)载体可有效抑制TRPV1表达。

本课题组前期研究采用1、5、10、20和40 mmol/L利多卡因刺激U87-MG细胞，发现随着利多卡因的浓度增高，细胞活力的抑制率相应增高。本研究发现10 mmol/L利多卡因对U87-MG细胞活力的抑制率为50%，而细胞在50%抑制率的状态时有利于观测利多卡因毒性损伤造成的细胞内钙离子浓度、线粒体膜电位和细胞凋亡等变化。因此，我们利用pSUPERretro-puro TRPV1(1)载体，将其转染U87-MG细胞后采用10 mmol/L利多卡因处理，结果发现TRVP1基因沉默组细胞内钙离子浓度低于TRVP1正常表达对照组，TRVP1基因沉默组细胞线粒体膜电位高于对照组；流式细胞分析显示利多卡因处理后TRVP1基因沉默组细胞凋亡率低于对照组[25]。这些结果表明，利多卡因可通过TRPV1蛋白通道使细胞内钙离子浓度增高，并可诱导细胞内钙库释放更多钙离子，从而导致线粒体受损、线粒体膜电位下降，这与Qiao等[26]的研究一致，而沉默TRPV1基因可降低利多卡因造成的钙离子内流，并减少细胞凋亡。Lu等[27]研究发现，布比卡因通过干扰氧化磷酸化使线粒体出现能量代谢障碍，导致线粒体膜电位下降，从而产生细胞凋亡。所以，局部麻醉药对细胞的毒性损伤主要体现在对线粒体的损伤上。本课题组发现利多卡因可能通过TRPV1通道蛋白途径介导线粒体损伤。

本实验成功构建了针对人TRPV1基因的shRNA逆转录病毒载体pSUPERretro-puro TRPV1，将其转染U87-MG细胞后建立了稳定干扰TRPV1表达的细胞株，为后续的实验研究TRPV1通道蛋白及相关信号通路在局部麻醉药所致神经毒性中的作用机制提供了基础。

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Objective To construct a recombinant retroviral vector expressing shRNA targeting human TRPV1 gene and observe its downregulation effect in the U87-MG cell line. Methods The oligonucleotides designed by Ambion on-line CAD software targeting to TRPV1 were cloned into the pSUPERretro RNAi plasmid. The recombinant vector was confirmed by DNA sequencing and enzyme digestion analysis. The pSUPERretro-puro TRPV1 shRNA retrovirus was prepared by calcium phosphate method and transfected into U87-MG cells. After the screening by purinase, the expression levels of TRPV1 mRNA and protein were detected by fl uorescent quantitation PCR and Western blotting. Results The expression vector pSUPERretro-puro TRPV1 shRNA was successfully constructed, which was conf i rmed by the DNA sequencing and the enzyme digestion analysis. The pSUPERretro-puro TRPV1 shRNA retrovirus can down-regulate expression of TRPV1 effectively after transfection in U87-MG cells. Conclusion The pSUPERretro-puro TRPV1 shRNA expression vector was successfully constructed. The expression of TRPV1 gene was down-regulated effectively in U87-MG cells transfacted with pSUPERretro-puro TRPV1 shRNA, which laid a basis for its application in the research of cell injury induced by lidocaine.

TRP; Lidocaine; Retrovirus

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.32.001

国家自然科学基金（81260176）

江西 330006 南昌大学第二附属医院麻醉科 （琚幼婷 卢俊胡衍辉 陈受琳 蔡俊赢 李昌）

卢俊 E-mail：454921043@qq.com