大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶的筛选

孙文洪 陈炳豪 朱丽梨 黄国贤 谢映红 黄雪琼

随着第3代头孢菌素如头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶和单环酰胺类抗菌药物在临床上的广泛应用，耐药的革兰阴性菌不断增加，造成治疗上的困难。目前导致院内感染的主要菌属仍为革兰阴性菌。革兰阴性杆菌对β-内酰胺类抗生素的主要耐药机制是产生β-内酰胺酶，其中以超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）为主，它位于质粒上，可由质粒在相同或不同菌种间水平传播；而AmpCβ-内酰胺酶主要是染色体介导的，但近年来质粒介导的AmpC酶也陆续在世界各地发现，且多见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。为调查广州番禺区中心医院两种酶的产出情况，本研究在367株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中筛选β-内酰胺酶。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 367株无重复大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌从本院2013年1月～2013年6月的各种临床标本中分离得到，其中大肠埃希菌156株，肺炎克雷伯菌211株。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.1.2 MH培养基 Oxiod产品。

1.1.3 药敏纸片 头孢泊肟（Cefpodoxime，CPD）、头孢他啶(Ceftazidime，CAZ)、头孢曲松（Ceftriaxone Sodium，CRO）、头孢噻肟(Cefotaxime Sodium，CTX)、头孢西丁(Cefoxitin，FOX)、头孢他啶/克拉维酸（CAZ/ Clavulanic acid，CLA）、头孢噻肟/克拉维酸（CTX/CLA）、头孢哌酮/舒巴坦（Sulbactam，SCF）、亚胺培南（Imipenem，IPM）、复方磺胺甲基异恶唑(Sulfamethoxazole，SMZ)、环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、阿米卡星(Amikacin，AMK)均为Oxoid产品。

1.1.4 微生物鉴定系统 采用Compact60系统（BioMé rieux，法国）进行鉴定。

1.2 方法

1.2.1 初筛试验 根据药敏纸片结果，将头孢泊肟或头孢他啶抑菌环直径≤22mm、头孢曲松抑菌环直径≤25mm、头孢噻肟抑菌环直径≤27mm，FOX≤17mm的菌株判定为疑产ESBLs菌株。若FOX>17mm的菌株疑为AmpC+。

1.2.2 ESBL表型确诊试验[1]在MH琼脂平皿上，按NCCLS标准方法接种待测菌，并贴上头孢他啶(CAZ)、头孢他啶/克拉维酸和头孢噻肟(CTX)、头孢噻肟/克拉维酸两对纸片，经35℃温育16～18h，观察结果，两对纸片中的任何一对的抑菌圈如相差5mm以上确认为ESBL。同时以肺炎克雷伯菌ATCC700603株作为阳性对照。

1.2.3 头孢西丁三相试验 采用Coudron反复冻融法[4]并作部分改动。挑取过夜培养的受试菌落数个，加入30mL胰蛋白胨培养基中，37℃180r/min振摇12～16h。－80℃及37℃反复冻融菌液5次，加入0.1mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液1mL，振荡混匀，离心提取酶粗制品。在MH琼脂平皿上按NCCLS标准方法接种大肠埃希菌ATCC25922，在平皿中央贴一FOX纸片，用无菌刀片在琼脂表面离FOX纸片边缘5mm处放射状切一裂缝，在裂缝里加入25μL粗提物，35℃孵育16～18h后，观察抑菌圈的形状，如裂缝与抑菌圈交接处出现细菌扩大生长， 而含氯唑西林的切槽无变化，说明裂缝里的粗提物使头孢西丁失活，氯唑西林抑制AmpC酶活性，为AmpC酶阳性。

2 结果

2.1 β-内酰胺酶检出率 全部实验菌株367株，115株产ESBLs，总阳性率为31.3%，其中大肠埃希菌156株，阳性43株（27.6%）；肺炎克雷伯菌 211株，阳性 72株（34.1%）。17株产AmpC酶，总阳性率为4.6%，其中大肠埃希菌阳性7株（4.5%）；肺炎克雷伯菌阳性10株（4.7%）。

2.2 药物敏感性检测 所检测的菌株对亚胺培南全部敏感，产酶株对阿米卡星、环丙沙星敏感性由40%～60%不等；产ESBLs菌株对头孢西丁也较敏感，在三代头孢菌素中，对头孢哌酮/舒巴坦的敏感性较好；产AmpC酶菌株对头孢西丁及三代头孢菌素的耐药性明显（见表1）。

3 讨论

ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生，肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌为其代表菌种。自1983年欧洲首次发现ESBLs以来，世界各地均有产ESBLs菌感染。新型超广谱β-内酰胺类抗生素广泛应用所产生的选择压力是导致ESBLs产酶菌发生的主要原因[1-2]，因此临床上应该严格限制该类药物作为常规经验治疗，以减轻抗生素的选择压力，防治产ESBLs菌株的产生和流行，可以选用如β-内酰胺酶抑制剂复合制剂、头霉素类、碳青霉烯类等作为替代品，可有效地减少了ESBLs产酶菌的临床分离率[3]。阿米卡星系氨基糖甙类抗生素，也可用于治疗产ESBLs菌引起的感染，但对产ESBLs菌的耐药率也较高，一般认为是编码产生ESBLs的质粒常携带着对这些抗生素耐药的基因。因此，在选择阿米卡星治疗产ESBLs菌引起的感染时，应根据药敏结果进行[4]。另外，由于不产ESBLs株对各种抗生素的敏感性均高于产ESBLs株，因此相应实验室应该进行ESBLs的常规检测并及时报告，这对于指导临床合理选择抗菌药物，提高疗效具有显著意义。

表1 367株大肠埃希菌和肺炎克雷白杆菌药敏结果

ESBLs产酶菌为15%，其中又多见于肠杆菌科细菌。在肠杆菌科细菌中以肺炎克雷伯菌最为常见，产ESBLs肺炎克雷伯菌占产ESBLs肠杆菌科细菌的16.9%～75.0%，其次产ESBLs的细菌是大肠埃希菌[5-8]。各个国家和地区产ESBLs菌株的发生率明显不同，这与该地区抗生素使用水平和细菌培养耐药性监测相关，日本、荷兰等国家产ESBLs菌株的发生率很低，而法国、印度等国家产ESBLs菌株的发生率很高，可有高达50%以上的克雷伯菌属的菌株产生ESBLs，而且具有较严重的耐药性[9]。本院大肠埃希菌中产ESBLs菌株的发生率27.6%，肺炎克雷伯菌中为34.1%，处于较低水平，这与本单位对抗菌药物管理及耐药性监测工作的开展相关。

AmpC酶是另一大类β-内酰胺酶，它主要由肠杆菌属、弗劳地枸橼酸菌、摩根摩根菌、黏质沙雷菌、铜绿假单胞菌产生的染色体介导的AmpC酶，以及近年来发现的质粒介导的AmpC酶，它主要位于大肠埃希菌、克雷白杆菌属、肠杆菌属细菌中。编码AmpC酶的质粒与编码ESBLs的质粒一样，可同时携带氨基糖甙类、四环素类和磺胺类等的抗药性基因。本研究的17株阳性株，除了对头霉素和三代头孢菌素耐药外，对氨基糖甙类和磺胺类也有不同程度的耐药。另外AmpC酶的特点之一是不能被β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸抑制。因此在治疗可疑产AmpC酶细菌的感染时，更应考虑选择合适的抗生素，碳青霉烯类抗生素和第四代头孢菌素如头孢吡肟可以作为产AmpC酶细菌有效的抗生素[1-2]。

于产AmpC的菌株的检测，NCCLS尚未出台标准[10]，临床实验室通常只能根据耐药表型（如对第二、三代头孢菌素耐药，而双纸片协同试验阴性，对第四代头孢菌素敏感等）综合判断推测。药敏试验中需包含头霉素类和含酶抑制剂的复合制剂是许多学者的共识。在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中，由于C类酶水解头孢西丁，Coudron等提出采用酶提取物三维试验法检测AmpC酶，但此法常规操作较为困难，因此有必要研究适合常规实验室的、操作快速简便的检测AmpC酶的方法。

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