脐带血来源间充质干细胞体外分离培养条件的优化分析

韩博文

脐带血（UCB）间充质干细胞（MSCs）在生物学和形态学特点上与骨髓来源的MSCs存在相似性，具有多向分化的特点，为发育在中胚层的早期细胞。经诱导分化和体外培养后，在一定条件下可向成骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞、软骨细胞等方向分化；可在基因治疗中作为载体细胞，也可在细胞治疗中作为种子细胞[1]。添加血清是MSCs培养的传统方法，但成功率较低，提高培养成功率对于UCB-MSCs具有非常重要的意义，是使脐带血资源得到良好利用，明确疾病诊断的关键。本次就主要影响UCB-MSCs体外培养的相关因素进行分析，并制定干预措施，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 准备青霉素、链霉素、马血清、胎牛血清、IMDM培养基。同时准备甲苯胺蓝、β-甘油磷酸钠、地塞米松、转铁蛋白等。对离心机、倒置显微镜、24孔培养板进行准备。实验所用的脐带血为足月产妇足月剖腹产婴儿及足月分娩儿，每次对脐带血进行50～100mL的采集。

1.2 方法 采集脐带血后用密度为1.077g/mL的细胞分离液以2500r/min，20min密度梯度进行离心操作后对单个核细胞MNCs获取。脐带血与Ficoll分离体的体积比为1：2～1：1。用IMDM基础培养基将分离后的细胞2次离心洗涤，对细胞密度进行调整后备用。筛选UCB-MSCs体外培养条件，USB-MSCs的生长过程中，细胞因子、细胞的接种密度、血清及基质支持单独起作用外，还相互作用，故开展相关研究。并依据结果对体外培养UCB-MSCs时，细胞因子添加的种类、适宜细胞因子用量进行筛选，对UCB-MSCs进行流式检测及诱导分化。

1.3 统计学方法 所有数据采用SPSS13.0统计学软件进行处理，计量资料进行t检验，计数资料进行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

UCB-MSCs培养中细胞的接触密度为最显著的影响因素，MSCs在接种密度越大的情况下，越易生长，培养出MSCs的几率越大。另外，在MSCs生长过程中添加细胞因子显示出较为明显的刺激生长作用，添加细胞因子GM-CSF和IL-3在高接种密度的基础上，使UCB-MSCs体外原代培养的成功率从约30%显著提高至90%以上（P＜0.05）。流式检测结果显示，细胞表达间充质干细胞在分离培养中的抗原，造血细胞不表达抗原，可向脂肪、软骨及成骨分化，一致于骨髓源的间充质干细胞，故对培养方法进行确定，可将大量优质的UCB-MSCs种子细胞向临床提供。

3 讨论

为使UCB-MSCs原代培养成功率有效提高，采用正交实验设计的方法对MSCs培养的主要影响因素进行考察。结果表明，在决定MSCs成功培养的重点因素中，除与细胞的接种密度相关外，还需适宜的细胞因子用量和种类。诱导分化分析和免疫表型分析证明，UCB-MSCs在传代培养下仍保持干细胞特性，其表达如CD13、CD166等相关的间充质干细胞表面标志，而不表达CD45、CD34及HLA-DR。在表面标志上，骨髓来源的间充质干细胞与脐带血来源的间充质干细胞相一致[2]。另外，在诱导分化的情况下，其向软骨、成骨、脂肪等多方向均有分化的能力被证实，诱导分化结果一致于骨髓来源的间充质干细胞。对细胞的表面受体产生刺激，并可对化学信号进行识别和结合，靶细胞在特异的生理效应方面起到了触发作用。

综上所述，采用诱导分化鉴定结果与流式细胞仪检测的结果表明，将细胞因子所培养出的成纤维状细胞在传统培养方法的基础上添加，为脐带来源的间充质干细胞，使UCB-MSCs的原代培养成功率显著提高，具有非常重要的研究价值。

[1]孙艳，段芳龄，陈香宇.体外诱导人脐血间充质干细胞向肝细胞样细胞分化的研究[J].胃肠病学和肝病学杂志，2004，6（13）：239-243.

[2]Chen X,Xu H,Wan C,et al.Bioreactor expansion of human adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].Stem Cells,2006,24(9)：2052-2059.