穿心莲内酯对人鼻咽癌细胞增殖以及Na+-K+-ATP酶活性的影响

王柏琦 程爱兰

穿心莲内酯对人鼻咽癌细胞增殖以及Na+-K+-ATP酶活性的影响

王柏琦 程爱兰

目的 观察穿心莲内酯(Andrographolide, AD)对人鼻咽癌CNE-2细胞的生长抑制作用，并研究其对凋亡的作用机制。方法 体外培养CNE-2细胞，分别用1.0mmol/L、3.0mmol/L、5.5μmol/L的AD处理细胞24h、48h、72h。CCK-8法检测细胞的增殖抑制率；流式细胞术分析细胞周期的变化；无机磷法检测Na+-K+-ATP酶活性改变。结果 AD能显著抑制CNE-2细胞的增殖，使其细胞周期停滞于S期和G2/M期；不同浓度的AD能降低Na+-K+-ATP酶活性且呈剂量依赖性，即当AD浓度为1.0μmol/L时，能使酶活性降低至83%，3.0μmol/L时其活性降为63.3%，而5.5μmol/L AD能使Na+-K+-ATP酶活性降低至42%。结论 AD对鼻咽癌细胞增殖具有一定的抑制作用，有望成为一种潜在的肿瘤治疗药物。

穿心莲内酯；鼻咽癌细胞；增殖抑制；肿瘤治疗药物

人类鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国较为常见的头颈部恶性肿瘤之一。其发生跟其他肿瘤类似，也是一个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程，涉及到宿主体内的基因型以及表型的变化[1-2]。NPC早期多无明显临床症状，往往就诊时已到中晚期，且大多患者因发生转移而失去手术的最佳时机。因此，了解NPC的作用机制并寻求有效的抗癌药物是当务之急。

目前，学者们把抗癌药物治疗策略转向抑制肿瘤侵袭生长过程中的特异性分子和通路的分子靶向治疗。在癌症的发生中，Na+-K+-ATP酶诱导细胞黏附及信号转导的作用不可忽视，目前认为，其表达及活性与癌症的发生发展密切相关，已成为当前抗癌药物的一个重要靶标。

众所周知，穿心莲内酯(And rographolide, AD) 是从我国传统中草药穿心莲中提取出来的一类二萜类化合物，常用于消炎解毒等方面的治疗，临床上常用于治疗各种感染性疾病[3]。最近研究表明，AD不仅有抗炎作用，而且具有抗肿瘤的潜能[4]。但是有关AD在NPC中的作用尚不清楚。本研究意在探讨AD对鼻咽癌细胞增殖有无影响，并从Na+-K+-ATP酶活性方面探讨其在NPC中的治疗价值。

1 资料和方法

1.1 细胞和主要试剂 鼻咽癌CNE-2细胞由中南大学湘雅医学院肿瘤所惠赠；穿心莲内酯（A nd ro）购自Sigm a-A ld rich公司，并用二甲基亚砜溶解使其成为浓度为15mmol/L的贮存液。胎牛血清、RPM I-1640培养基、抗生素均购于美国Invitrogen。其他试剂均购于上海生工。

1.2 细胞培养与处理 人鼻咽癌细胞系CNE-2用含10%胎牛血清的RPM I-1640培养基（pH 7.2）在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下进行传代培养。实验细胞密度调整为108/L，分为阴性对照组和AD处理组。其中对照组加入等量的RPM I-1640培养基，处理组加入1.0mm ol/L、3.0mm ol/L、5.5μm ol/L的AD，在37℃下分别处理细胞24h、48h、72h。

1.3 CCK-8检测鼻咽癌细胞增殖实验 取长势良好的CNE-2细胞，调整细胞浓度为5×104/m L后接种于96孔板中（每孔100uL），每组设立5个复孔，孵育24h。待细胞贴壁后，加入不同浓度的AD孵育24～72h。细胞处理结束后，加入10μL CCK-8溶液（注意避免产生气泡），37℃继续培养1～4h。用酶标仪测定其在450nm处的吸光度。细胞抑制率为：空白组OD值-处理组OD值/空白组OD值×100%。

1.4 FCM法检测CNE-2细胞周期 采用AD处理过的CNE-2细胞（约1×106个），实验组和对照组均加入75%的乙醇1.5m L，4℃固定过夜。上机前处理：将固定后的CNE-2细胞用低温离心机离心，条件为1000rpm 5m in，丢弃上清，再用PBS洗涤2～3次。最后用200μL的预冷的PBS重悬浮CNE-2细胞，最后加入PI染液0.5m L并避光染色30m in。染色完后用200目尼龙网过滤，用FCM检测细胞核中PI荧光强度，检测条件：波长为488nm，变异系数<2%，并通过专业软件确定不同时间点的细胞比例。

1.5 Na+-K+-ATP酶活性分析 通过测定酶促反应释放的无机磷（Pi）的含量多少来确定ATP酶的活性改变情况。其反应体系包括20mm ol/L KC l、100mmol/L NaC l、30mm ol/L T ris-HC l缓冲液（pH 7.4）、2mmol/L ATP以及新鲜细胞线粒体分离物。反应体系加入ATP后，30℃孵育15m in，接着加入15%三氯乙酸终止反应。通过测量640nm处的吸光度分析释放的无机磷的含量。ATP酶活性的定义为1m g蛋白质1h内催化ATP生成1μmol/L 无机磷的量为1个单位ATP酶活性。

1.6 统计学方法 所有数据采用SPSS13.0统计学软件进行处理，以上实验所得到的计量资料数据均用（）表示，重复3次，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AD对CNE-2细胞增殖影响 本研究采用CCK-8法检测AD对CNE-2细胞的体外生长呈时间-剂量依赖性。从表1可以看出，浓度分别为0、1mm ol/L.0、3.0mm ol/L、5.5μm ol/L的AD体外能显著抑制CNE-2细胞。不同浓度AD在同一的时间点对CNE-2抑制率剂量增加而递增。而同一药物浓度随作用时间的延长其抑制率也明显增强。经统计学分析，差异显著（P<0.05）。

2.2 AD对CNE-2细胞周期的影响 0、1.0mm o l/L、3.0mmol/L、5.5μmol/L的AD作用CNE-2细胞72h后，AD处理组相对于对照组，不同浓度的AD能使CNE-2细胞的G0/G1期细胞比例随AD浓度增加而减少（P<0.05），而S期细胞和G2/M期比例增高反而升高（P<0.05），详见表2。

2.3 不同浓度AD对Na+-K+-ATP酶活性的影响 不同浓度的AD能不同程度抑制CNE-2细胞Na+-K+-ATP酶活性。其中AD浓度为1.0μmol/L时，能使酶活性降低至83%，3.0μmol/L时其活性为63.3%，而5.5μmol/L AD能使Na+-K+-ATP酶活性降低至42%，见图3所示。

表1 不同浓度AD在不同作用时间下对CNE-2细胞增值的抑制率

表2 不同浓度AD作用CNE-2细胞72h后对其细胞周期影响分布

图3 不同浓度AD对CNE-2细胞Na+-K+-ATP酶活性的影响aP<0.05 VS 对照组

3 讨论

鼻咽癌患者发病早期通常选择放射治疗，但总体效果欠佳，原因是不仅鼻咽癌的复发率较高，且患者就诊时大多已经到了中晚期。为了选择更为有效的治疗方法，人们坚持不懈地尝试各种方法，包括基因治疗、免疫治疗以及化疗等[5-7]。但现有的治疗手段以及抗癌药物仍然得不到比较满意的结果，因此寻求新的药物是当务之急。

本研究中，我们的研究证实AD能显著抑制鼻咽癌CNE-2细胞的生长，呈剂量和时间依赖性及使其阻滞于细胞生长周期的S期和G2/M期，并能有效地降低Na+-K+-ATP酶活性。这些研究结果表明AD可能是一种有效延缓鼻咽癌进展的潜在性药物，其作用机制可能是降低Na+-K+-ATP酶活性，减少细胞间黏附及信号转导实现的。Na+-K+-ATP酶为三羧酸循环的关键酶，由两个亚单位组成，即1个α-亚单位和1个β亚单位组成的异源二聚体。其中α-亚单位是一种跨膜蛋白，可促进细胞外K+和细胞内Na+之间交换[8-9]，所以该酶可调节体内外离子间的动态平衡。一般认为引起Na+-K+-ATP酶活性发生改变各种因素，均可引起线粒体跨膜势能的改变，因而导致细胞凋亡及释放凋亡相关分子[10-11]。在本研究中，AD的确能引起Na+-K+-ATP酶活性降低，表明AD引起鼻咽癌细胞中Na+-K+-ATP酶的α-亚单位功能发生了改变或破坏了线粒体膜的功能，表明线粒体功能障碍可能是AD诱导鼻咽癌细胞凋亡的最终结局[12]。

综上所述，AD能显著抑制CNE-2细胞的增殖并能降低Na+-K+-ATP酶活性，从而引起CNE-2细胞凋亡。这表明AD可能是一种潜在的抗癌药物。但作为一种新的抗癌治疗药物，对鼻咽癌细胞种类以及癌症的分期的不同可能疗效不同，并且其在体内研究的有效性及安全性尚需进一步研究。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2012.26.017

421001 南华大学肿瘤研究所 （王柏琦 程爱兰） 421001南华大学附属第二医院肿瘤内科（王柏琦）