Wnt8a在小鼠胚胎心肌分化中的作用

高胜利 高淑红 侯泽

Wnt信号通路对许多物种的胚胎心肌分化具有重要作用[1]。对Wnt8a在胚胎心肌细胞分化过程中的作用，存在两种相反的观点。一种观点是Wnt8a抑制胚胎心肌分化[2]；另一种观点是Wnt8a促进胚胎心肌分化[3]。小鼠胚胎干细胞(ES细胞)在二甲基亚砜诱导(DMSO)下分化成心肌细胞，体外心肌细胞分化与体内完整胚胎心肌发育过程相符，鉴于此，本文以DMSO作为诱导剂，诱导ES细胞心肌分化，检测分化过程中Wnt8a的表达和作用，研究其在胚胎心肌分化中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 ES细胞来源

来自于129纯系小鼠胚胎干细胞系(ES-D3)，25～30代。

1.1.2 主要试剂

DMEM高糖培养基，胎牛血清，二甲基亚砜，Frizzled-8/Fc Chimera，RNA提取试剂盒。引物设计见表1。

表1 引物设计

1.1.3 主要仪器

医用净化工作台，CO2培养箱，倒置显微镜，凝胶成像系统，PCR仪。

1.2 实验方法

1.2.1 ES细胞的复苏培养

ES细胞复苏后，接种于小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上。将已培养2～3天生长旺盛的细胞克隆，消化成单细胞悬液，以1：3～1：6传代，培养基颜色变黄时半量换液。

1.2.2 实验分组

实验组：ES细胞基础培养基加1%DMSO；对照组：ES细胞基础培养基加1%DMSO和Frizzled-8/Fc(200ng/ml)。

1.2.3 细胞分化培养

将ES细胞消化吹打成单细胞悬液，转入培养皿悬浮培养4天形成拟胚体，吸取拟胚体，转入培养皿中(做PCR)和36孔培养板中，每孔一个拟胚体，加入分化培养基。观察分化细胞形态及是否出现自发性收缩，对比分化率。

1.2.4 Wnt8a mRNA检测

从贴壁培养第1天起，每日提取总RNA，RT-PCR检测分化过程中Wnt8a mRNA的表达。

1.3 统计学处理

应用SPSS统计软件包11.5对数据进行处理。数据均用(±s)表示，采用student t检验。

2 结果

表2 不同诱导剂对胚胎干细胞分化为心肌细胞的影响

图1 分化第2，3，4天Wnt8a(400bp)的表达

2.1 ES细胞分化为心肌样细胞

ES细胞贴壁培养第2天起，两组均可见自发节律性收缩的心肌样细胞，收缩频率45～75次/分，持续10天。实验组分化率为92.22%，对照组分化率为37.78%，两组差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 Wnt8a在分化过程中的表达

两组在分化第2、3、4天检测到Wnt8a表达，第5天后未检测到表达。

3 讨论

研究表明Wnt8a抑制胚胎心肌发育，Wnt8a在蛙类、鸡、小鼠胚胎中临近心前区的组织中分泌，心肌的形成取决于Wnt3a和Wnt8a的抑制。将Wnt8 cDNA注射到鸡胚4细胞期的2背分裂球，并培养至23或30期，抑制心肌特异因子nkx-2.5的表达[2]。也有研究认为Wnt8a促进胚胎心肌发育，用产生Wnt8a病毒感染鸡胚的侧中胚层，心肌特异基因的表达未受到影响，未抑制正常心肌分化[3]。

二甲基亚砜能诱导ES细胞分化成心肌细胞，1%DMSO诱导效应最高，分化率达到96.7%[4]。两组诱导剂诱导ES细胞，可见自动节律性收缩细胞，分化为心肌样细胞，分化过程Wnt8a表达阳性。对照组加入了Frizzled-8/Fc，Frizzled-8/Fc与Wnt受体Frz结合，竞争性抑制Wnt8a与Frz结合，阻断Wnt8a作用途径[5]，尽管对照组Wnt8a表达阳性，但分化率下降，说明了Frizzled-8/Fc抑制了Wnt3a可促进在ES细胞定向分化为心肌细胞的作用。由此推断，Wnt8a促进小鼠胚胎心肌分化。本实验还发现，Wnt8a在分化开始第2，3，4天表达，在第5天后未能检测到，提示Wnt8a对胚胎心肌分化的作用依赖于分化的时期，仅仅在分化早期具有促进作用。随着研究的不断深入，对于Wnt信号转导通路在心肌分化和心脏形成的作用，将有更清晰的认识，有助于了解胚胎心肌分化和心脏发育机制。

[1]Eisenberg LM,Eisenberg CA.Wnt signal transduction and the formation of the myocardium[J].Dev Biol,2006,293:305-315.

[2]Leonard M,Eisenberg.Eisenberg Evaluating the Role of Wnt Signal Transduction in Promoting the Development of the Heart[J].The Scientific World,2007,7:161-176.

[3]Leonard M,Eisenberg.Eisenberg Evaluating the Role of Wnt Signal Transduction in Promoting the Development of the Heart[J].The Scientific World,2007,7:161-176.

[4]王秀丽,虞星炬.二甲基亚砜诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化伴随凋亡现象的研究[J].解剖学杂志,2005,28(06):609-614.

[5]Hsieh JC,Rattner A.Biochemical characterization of Wnt-frizzled interactionsusing a soluble,biologically active vertebrate Wnt protein[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1999,96:3546-3551.