靶向凝血因子FⅨa-FⅧa复合物结合位点的新型抗栓抗体

孙天瑶，蒋时枫，徐 沁，刘俊岭，党素英#，樊雪梅#

1.上海交通大学生物化学与分子细胞生物学系，上海 200025；2.上海交通大学生命科学技术学院生物工程系，上海 200240

血栓栓塞性疾病是一类以动静脉和微血管血栓形成或栓塞为特点的临床常见疾病；血栓形成后血流受阻，或栓子脱落导致下游血流中断，将会造成组织器官的缺血和坏死［1］。全球约有1 790万人死于心血管疾病，占全球死亡人数的31%［2］。血栓形成是引发各类严重心脑血管疾病的重要因素，血栓性疾病已成为当今社会威胁人类健康和生命的首要原因［1］。血栓栓塞性疾病的主要治疗手段是抗栓治疗，包括抗凝、抗血小板以及溶栓［3］。其中，抗凝治疗主要通过抑制凝血级联反应中不同的凝血因子阻断凝血过程［4］。目前，临床上使用的抗凝药物有肝素及其衍生物、维生素K 拮抗剂（如华法林）［5］、小分子抑制剂（利伐沙班、达比加群等），均可作用于凝血瀑布的共同凝血途径（凝血因子Ⅱa、Ⅹa），难以避免对生理性止血功能产生影响，因而这些药物存在严重的出血危险［6］，特别是脑出血［7-8］。由于内源性凝血途径与病理性血栓形成密切相关而非止血功能所必需［9］，内源性凝血因子的选择性抑制剂已成为新型抗凝血药物研究的热点［10］。

凝血因子Ⅸa（coagulation factor Ⅸa，FⅨa）是内源性凝血途径中关键的凝血因子，是唯一可溶形式的凝血蛋白［11-12］。FⅨ可以在聚集的血小板上由FⅪa 直接激活成为FⅨa，FⅨa 能够有效地从组织因子承载细胞扩散到血小板，成为凝血链起始和放大阶段之间的关键环节［4］。FⅨa 通过形成FⅨa-FⅧa 复合物激活FⅩ，该过程的速度是组织因子（tissue factor，TF）-FⅦa 复合物的50 倍以上［13］，同时也是凝血酶产生的限速步骤［14-16］。Lollar等［17］在体外证明了FⅨa 活性位点抑制剂（FⅨai）可抑制凝血反应；Benedict 等［18］在实验动物模型中证明了FⅨai 可以预防血栓形成但对生理性止血影响较小。因此，FⅨa 被认为是抗血栓形成的安全靶标［19-21］。目前多种针对FⅨa 的抑制剂正在被开发，包括小分子抑制剂、大分子竞争性活性位点阻断抑制剂、单克隆抗体、RNA适配体等［22］。

本课题组在此研究中制备了一株以FⅨa-FⅧa为靶点的高亲和性单克隆抗体FⅨa-4，FⅨa-4 不直接与FⅨa 的底物催化位点结合，而是占据了FⅨa 和FⅧa 的结合区域，针对该作用位点的新型抑制剂具有良好的抗凝作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及细胞来源 BALB/c 小鼠、裸鼠均为SPF级，购自苏州西山生物科技有限公司，生产许可证号为SCXK（沪）2018-0003。实验动物由上海交通大学医学院动科部饲养在SPF 屏障系统中，实行严格的微生物学控制，使用许可证号为SCXK（沪）2018-0003。动物实验操作均符合伦理规范。骨髓瘤细胞SP2/0来源于中国科学院细胞库，目录号为TCM18。

1.1.2 主要试剂及仪器 半固体培养基购自美国STEMCELL 公司，完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、聚乙二醇（PEG）、四甲基十五烷（pristane） 购自美国Sigma 公司，人凝血因子FⅨa、FⅩ购自美国Enzyme Research Laboratories 公司，活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）试剂、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）试剂、Owren′s veronal缓冲液（Owren′s veronal buffer， OVB） 购自德国Siemens 公司，凝血酶、磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸混合物（PC/PS）购自法国Hyphen Biomed 公司，蛋白G 琼脂糖树脂购自上海翊圣生物科技有限公司，人凝血因子FⅧ购自上海莱士血液制品股份有限公司，ELISA-TMB 显色液购自美国Gibco 公司，正常人混合血浆购自美国Instrumentation Laboratory 公司，SPECTROZYME®FⅨa发色底物购自加拿大Biomedica Diagnostics 公司，蝰蛇毒液（Russell′s viper venom，RVV） 购自法国Diagnostica Stago 公司，S2765 发色底物购自意大利Chromogenix 公司，HRP 标记的鼠源二抗购自美国Jackson Immuno Research Laboratories公司。

APTT 和PT 仪器（STart 4 fibrinometer） 购自法国Diagnostica Stago 公司，酶标仪（type1530） 购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 制备以FⅨa为靶点的单克隆抗体

1.2.1 免疫小鼠及细胞融合 免疫SPF级BALB/c雄性小鼠，6～8周龄4只。初次免疫将FⅨa抗原与弗氏完全佐剂混合，FⅨa 终浓度为100 μg/100 μL，2 只足垫各注射50 μg/50 μL；第2 次免疫，将弗氏完全佐剂替换为弗氏不完全佐剂；第3 次免疫，FⅨa 抗原用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）稀释至100 μg/100 μL，进行腹腔注射；第4 次免疫，即加强免疫，以100 μg/100 μL 剂量进行尾静脉注射。共进行4 次免疫，每次免疫间隔2周。

加强免疫后第3日取免疫小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞SP2/0在PEG作用下进行细胞融合，获得杂交瘤细胞。

1.2.2 抗体阳性细胞株筛选和克隆化 杂交瘤细胞培养7 d 后， 采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）进行抗体阳性检测。在ELISA板中包被抗原FⅨa 0.1 μg/100 μL，37 ℃孵育1.5 h；再用2%牛血清白蛋白37 ℃封闭1 h；然后加入细胞培养上清液，37 ℃孵育1.5 h；接着加入鼠源二抗，37 ℃孵育30 min；最后加入显色底物TMB 室温避光孵育5 min 后，加入终止液2 mol/L H2SO4，终止反应。根据在酶标仪450 nm 处测量的吸光度，筛选抗体阳性细胞株；然后在半固体培养基中进行克隆化培养，7 d 后挑选出单克隆到96 孔板中，按上述ELISA 再次进行筛选，最终获得抗体阳性的单克隆细胞株。

1.2.3 抗体测序 收取足量抗体阳性细胞，提取RNA，反转录为cDNA，使用小鼠抗体测序引物进行PCR。反应条件：98 ℃300 s；98 ℃10 s，58 ℃15 s，72 ℃30 s，共40 个循环；72 ℃300 s。最后将PCR 产物送上海桑尼生物科技有限公司测序。

1.2.4 腹水制备及抗体纯化 选择雄性裸鼠4只，6～8周龄。提前7 d 注射pristane 0.5 mL/只，然后在小鼠腹腔注射杂交瘤细胞（0.5～1）×106个/0.5 mL；7～10 d 后可见裸鼠腹部胀大，在左下腹腔刺入针头，收集腹水至离心管中，2 400×g离心10 min，收集上清液，加入叠氮钠使之终浓度为0.02%。

按照蛋白G 琼脂糖纯化树脂的说明书流程，将上述收集的腹水依次进行平衡、上样、洗杂、洗脱；最后用超滤管（截留相对分子质量≥30 000）对洗脱液进行超滤浓缩，得到高纯度的单克隆抗体。

1.3 抗体亲和力检测

采用ELISA 进行抗体亲和力检测。在ELISA 板中包被抗原FⅨa 0.1 μg/100 μL，37 ℃孵育1.5 h；再用2%牛血清白蛋白37 ℃封闭1 h；然后分别加入不同浓度梯度的抗体，37 ℃孵育1.5 h；接着加入鼠源二抗，37 ℃孵育30 min；最后加入显色底物TMB 室温避光孵育5 min 后，加入终止液2 mol/L H2SO4，终止反应。酶标仪检测450 nm处吸光度。

1.4 抗凝血测定

1.4.1 APTT 首先将仪器及相关试剂预热至37 ℃。然后将抗体用OVB 稀释，再选定APTT 程序，放置反应杯。依次加入50 μL APTT 试剂、50 μL 正常人混合血浆和磁珠，按启动键使磁珠开始振荡。然后加入25 μL抗体，按下计时键开始计时，180 s后加入25 μL 50 mmol/L CaCl2，同时按手柄上的测量键。观察磁珠振荡直至血浆凝固，记录仪器上的秒数。最后，根据血浆中抗体终浓度的对数值和凝血时间绘制曲线。

1.4.2 PT 首先将仪器和试剂预热至37 ℃。然后将抗体稀释于正常人混合血浆中，再选定PT 程序，放置反应杯。加入磁珠，按启动键使磁珠开始振荡，然后加入50 μL 含抗体的正常人混合血浆，并按下计时键开始计时。60 s 后加入100 μL PT 试剂，同时按手柄上的测量键。观察磁珠振荡直至血浆凝固，记录仪器上的秒数。根据血浆中抗体终浓度的对数值和凝血时间绘制曲线。

1.5 发色底物法检测抗体对酶活性的影响

首先将酶标仪设置为37 ℃，选择动力学循环模式，测量吸光度的动态变化值，总时间设置为10 min，间隔5 s，循环次数为121次。然后参考SPECTROZYME®FⅨa发色底物的说明书，在96孔板中依次加入100 μL Tris缓冲液（50 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L CaCl2、33%乙二醇，pH=7.4）、10 μL FⅨa 蛋白（2 μmol/L）、2.5 μL 抗体或对照，最后加入12.5 μL 的FⅨa 发色底物（10 mmol/L），触发反应；测量其在405 nm处吸光值的变化情况ΔD/min。

1.6 FⅨa与单克隆抗体相互作用结合位点的预测

FⅨa的催化结构域三维模型依据FⅨa-抑制剂复合物（PDBentry：3LC3）的晶体结构构建而成。考虑到3LC3中氨基酸残基依照胰凝乳蛋白酶编号，下述用此编号的FⅨa 残基均在编号前加c 字符。通过SabPred 网站的Abody Builder［23］来预测单克隆抗体可变区的三维结构。通过ClusPro 进行抗体与FⅨa 的对接，其中在对接的过程中使用抗体模式屏蔽抗体的非互补性决定区（complementarity determining region，CDR）区域［24］。对接结果由open-source PyMOL（2.5.0版）提供［25］。

1.7 抗体与FⅧa结合FⅨa的竞争实验

1.7.1 FⅧ的激活 在125 μL缓冲液（20 mmol/L HEPES、300 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2）中加入1 U/100 μL凝血酶和100 μg/25 μL FⅧ，37 ℃孵育10 min，得到FⅧa（终浓度约为0.4 mg/mL）。最后加入1 U 水蛭素（hirudin），防止FⅧa崩解［26］。

1.7.2 抗体对FⅨa-FⅧa 复合物激活FⅩ的抑制作用检测 首先将50 ng/2 μL PC/PS、5 μL FⅨa（20 nmol/L）、10 μL FⅩ（3 μmol/L）混合，然后加入预先混合好的8 μL FⅧa（80 μg/mL）和5 μL 抗体，37 ℃孵育15 min。再加入20 μL EDTA（20 mmol/L）终止反应，最后加入150 μL 含0.1% PEG8000 的TBS-Ca2+缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L CaCl2、0.1%牛血清白蛋白）稀释反应产物［27］。

将酶标仪设置为37 ℃，选择动力学循环总时间设置为5 min，间隔10 s，循环次数为31次。在96孔板中加入40 μL 反应产物，再加入40 μL 发色底物S2765（1 mmol/L），触发反应［28］。测量其在405 nm处吸光值的变化情况ΔD/min。

1.7.3 FⅧa 纠正抗体对FⅨa-FⅧa 复合物抑制作用的检测 选取“1.7.2”中合适的抗体作用浓度，按照同样的方法，将上述反应体系中的5 μL 抗体换为2.5 μL FⅧa 和2.5 μL抗体（终浓度不变），测量其在405 nm 处吸光值的变化情况（ΔD/min）。纠正率为加入FⅧa 后对应的FⅩa生成量减去未加入FⅧa 体系的FⅩa 生成量的差除以未加入FⅧa体系的FⅩa生成量。

1.7.4 建立FⅩa 生成量与裂解底物速率的标准曲线 按说明书操作，首先将25 μL FⅩ（200 nmol/L）、25 μL RVV（42 nmol/L）、50 μL TBS-Ca2+缓冲液混合，37 ℃孵育30 min 后，FⅩ被激活为FⅩa，此反应体系中完全活化的FⅩa终浓度为10 nmol/L。

然后将酶标仪设置为37 ℃，选择动力学循环模式，总时间设置为5 min，间隔10 s，循环次数为31 次。在96 孔板中加入40 μL 不同浓度FⅩa 和40 μL 发色底物S2765（1 mmol/L），触发反应，测量其在405 nm 处吸光值的变化情况（ΔD/min），即为裂解底物速率。根据FⅩa的终浓度和对应的反应速率绘制标准曲线。

2 结果

2.1 APTT、PT评估单抗的抗凝作用

先后通过免疫小鼠、杂交瘤融合、抗体测序、细胞表达与纯化技术得到1 株与人FⅨa 具有高亲和力的单克隆抗体（图1A，EC50=94.67 ng/mL），命名为FⅨa-4。接着检测该单抗对APTT 和PT 的影响，用来评估其在内源性凝血途径和外源性凝血途径中的作用。分别将不同浓度的单克隆抗体（终浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39 μg/mL）加入到APTT 或PT 反应体系中。实验结果显示，与对照组相比，FⅨa-4使APTT 显著延长；且随着FⅨa-4 浓度的增加，其对APTT 的延长效应也增强，最大可使APTT 延长至88.8 s，相当于对照组25.5 s 的3.5 倍（图1B，IC50=7.71 μg/mL）。这一延长效应明显高于目前抗栓药物要求的2.5 倍APTT延长效应。而FⅨa-4 基本不影响PT（图1C）。以上实验数据表明FⅨa-4 特异性地抑制了内源性凝血途径，而不作用于FⅩ、FⅡ等外源性凝血途径和共同凝血途径中的凝血因子。

图1 FⅨa-4与FⅨa的亲和力及对内源性和外源性凝血途径的影响Fig 1 Affinity between FⅨa-4 and FⅨa and its effect on endogenous and exogenous coagulation pathways

2.2 FⅨa-4不直接结合FⅨa的催化活性位点

在内源性凝血途径中，FⅨa作为酶催化FⅩ形成FⅩa来介导凝血瀑布反应的。因此，为了研究FⅨa-4 的抗凝机制，我们首先检测了其对FⅨa 催化活性的影响，用酶催化底物裂解的速率来反映酶的催化活性。分别将不同浓度的FⅨa-4（终浓度为1 000、100、10、1、0.1、0.01、0.001 μg/mL）与FⅨa 蛋白混合孵育3 min，再加入FⅨa发色底物进行反应，实时监测D（405 nm）。ΔD/min 反映了酶的催化活性。实验结果显示，FⅨa-4 对FⅨa 的酶催化活性无明显影响（图2）。此实验结果表明FⅨa-4 并不是通过直接结合F Ⅸa 的催化活性位点发挥抗凝活性。

图2 FⅨa-4对FⅨa催化活性的影响Fig 2 Effect of FⅨa-4 on FⅨa catalytic activity

2.3 FⅨa-4抗体与FⅨa催化结构域结合位点的预测

为了进一步研究FⅨa-4 的抗凝作用机制，我们利用蛋白对接的方法对FⅨa-4 与FⅨa 的结合位点进行预测。由于蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB）中没有经实验测定的FⅨa 全长蛋白的完整结构，同时考虑到我们主要关注抗体对于FⅨa 催化活性的影响，因此我们基于一个FⅨa 催化结构域的抑制剂复合物结构建立了FⅨa 催化结构域的三维模型；同时利用抗体结构预测工具建立了FⅨa-4 结合区域的三维模型，通过蛋白-蛋白对接方法预测了两者结合的最优构象集合。该构象集合中，总共979 个对接构象形成了30 个聚类。对每个聚类的代表构象观察发现，大多数FⅨa 与FⅨa-4 的结合构象共享1 个结合表面，其中接触频率较高的残基列于表1 中。在所有的构象中，FⅨa-4 与FⅨa 之间的结合都不阻碍FⅨa催化位点的底物进出（图3A）。同时，虽然对接过程中并未考虑FⅨa 与抗体本身的构象变化，但考虑到结合位点与催化位点相距较远，且催化结构域三维结构比较稳定，受结合影响产生较大形变的可能性不高，因此可以初步推测FⅨa-4结合并不直接影响FⅨa的催化。

另一方面，这些接触残基与之前预测的FⅨa-FⅧa结合面［29］有相当部分重叠（图3B、C）。例如，表1 中FⅨa 的Asn-c 93、Lys-c 132、Arg-c 165 和Thr-c 175 等残基也参与FⅨa 与FⅧa 的结合，而且Ala-c 95、Lys-c 98、Asp-c 164、Lys-c 173、Tyr-c 177 残基在序列上与预测的FⅨa-FⅧa结合残基也很接近，均间隔少于2个残基位点。在三维结构中这些残基占据了位于FⅨa蛋白c170-螺旋和c131-螺旋之间的共同表面，这恰恰是FⅨa与FⅧa的558-螺旋相结合的关键区域，因此FⅨa-4 可能与FⅧa 在FⅨa的结合上形成竞争关系。总之，对于FⅨa-4 与FⅨa 催化结构域结合位点的预测表明FⅨa-4 并不是通过直接结合FⅨa 的催化活性位点而降低其活性，而是与FⅧa 竞争性结合FⅨa，阻碍了FⅧa-FⅨa复合物的形成，从而抑制内源性凝血途径中FⅧa对于FⅨa的激活，从而降低了FⅨa的催化活性。t

图3 FⅨa-4（红色）与FⅨa催化结构域（蓝色）的结合面预测Fig 3 Binding surface prediction between the antibody FⅨa-4(red)and FⅨa catalytic domains(blue)

表1 FⅨa与FⅨa-4结合面上的接触残基Tab 1 Most frequent residues of FⅨa contacting with FⅨa-4

2.4 FⅨa-4与FⅧa竞争性结合FⅨa

假定FⅨa-4与FⅧa竞争性结合FⅨa，那么随着FⅧa浓度的增加，FⅨa-4 的作用会减弱。首先我们建立了模拟体内FⅨa-FⅧa复合物产生FⅩa的体外模型。在此体系中加入PS/PC、FⅨa、FⅧa 与FⅩ，反应产生FⅩa，然后向此反应体系中加入FⅩa发色底物来确定FⅩa的产生量。结果（图4A）发现，将不同浓度的FⅨa-4（终浓度为1 560、780、390、156、78、39、15.6、7.8 pmol/L）加入到此体系中，FⅨa-4 以剂量依赖的方式抑制了FⅩa 的生成。FⅨa-4 的浓度达到400 pmol/L 就使FⅩa 的生成几乎完全被抑制。在此体系（抗体浓度为400 pmol/L）中添加FⅧa 至不同浓度（终浓度为1.1、1.6、2.5、3.7、5.6、8.3、12.5 nmol/L），结果（图4B）显示随着所加FⅧa 浓度的升高，抗体的抑制作用逐渐被纠正，纠正率达到近50%。该实验结果验证了FⅨa-4 与FⅧa 竞争性结合FⅨa发挥抗凝作用这一推测。

图4 FⅨa-4与FⅧa竞争性结合FⅨa的验证Fig 4 Verification of FⅨa-4 competed with FⅧa in combination with FⅨa

3 讨论

目前使用的抗凝剂有多种局限性，包括不可预测的药代动力学、缺乏可逆性，在某些情况下还有免疫原性［30］；开发安全有效的抗栓药物仍是当代医药领域的研究热点。在选择靶向的凝血因子时，有2个重要的考虑因素。首先，在凝血瀑布反应显著放大发生之前阻断该通路。第二，以限速步骤为目标，应在最宽的治疗范围内提供有效的抗凝作用［31］。FⅨa 是内源性凝血途径中关键的凝血因子［4］。有研究［32］表明，靶向FⅨa 是有效降低缺血性并发症而不增加出血并发症的非常有前景的治疗方法。

单克隆抗体具有结合抗原特异性强、半衰期长等特性。随着单克隆抗体技术的不断发展，抗体药物在疾病预防、诊断和治疗方面发挥着举足轻重的作用。本研究中先后通过杂交瘤技术、抗体测序、细胞表达与纯化技术得到了一种新型的抗FⅨa 单克隆抗体FⅨa-4，并通过APTT、PT 功能检测，描述了FⅨa-4 的抗栓特性。虽然FⅨa-4 延长APTT的作用是剂量依赖性的，但大量增加抗体浓度并未使APTT 不受控制地延长，而是将APTT 延长比例限定在3.5倍的范围内。这一结果表明FⅨa-4有效治疗浓度窗口较大，不易增加出血风险，符合临床应用需求。

在探究其抗栓活性的作用机制时我们发现，FⅨa-4与之前报道的FⅨa 抑制剂不同，它并不直接作用于FⅨa的酶催化活性位点，而是占据了FⅨa 和FⅧa 之间的大部分结合区域，阻断了FⅨa-FⅧa复合物形成，进而影响其催化FⅩ向FⅩa 的转化而引发抗凝作用。更有意思的是，FⅨa-4 可基本阻断体外FⅩa 的产生，而补充FⅧa 可使这一抑制作用得到纠正；也就是说FⅨa-4 的抗栓作用随着FⅧa 浓度的增加得到部分逆转。与现有抗栓药物相比，抗栓作用可逆是现今开发新型安全有效抗栓药物需要考虑的，因为在临床用药过程中可利用这一特性预防或治疗过度抗凝而引起的不可控出血。在接下来的研究中，我们将测试食蟹猴、鼠、犬等不同动物种属的FⅨa 与FⅨa-4 反应，以找到可与FⅨa-4 相互作用的动物模型，评测靶向FⅨa-FⅧa结合位点的单克隆抗体FⅨa-4在体内的药代动力学、药效学及安全性。

综上所述，本研究制备了一种新型抗栓抗体，其作用机制为通过与FⅧa竞争结合FⅨa上的位点，抑制FⅧa-FⅨa 复合物的形成进而发挥抗凝作用。该研究成果不仅为治疗血栓提供了新的思路，也为目前仍未明确的FⅧa与FⅨa结合位点提供了间接证据。