水解橄揽植物水对小鼠的抗炎作用

凯瑟琳·比尔特

摘要：水果和蔬菜中的简单多酚是有效的抗氧化剂。3，4-二羟基苯基乙醇或羟基酪醇 （HT， hydroxytyrosol）是清除自由基最有效的物质之一，这是一种主要存在于欧洲油橄榄或橄榄植物中的简单酚。H在橄榄果肉的含水部分中含量最高，在橄榄油部分和叶子中也有痕量。对于这些实验结果，我们评估了橄榄植物水（OVW， olive vegetation water）的抗炎活性，我们之前证明它具有强大的抗氧化活性。由于一些具有抗氧化活性的简单多酚类物质显示出不同的抗炎活性，我们测试了OVW和HT抑制肿瘤坏死因子（TNF- ）产生的能力，TNF-是炎症中的关键细胞因子。在经脂多糖 （LPS） 处理的BALB/c小鼠炎症模型中以 125 毫克/小鼠 （500 毫克/千克） 的剂量注射OVW将降低95%血清中的TNF-水平。在人单核细胞系THP-1中，以0.5 g/L（相当于0.03 g/L简单多酚）浓度的OVW处理细胞可降低50%由LPS诱导的TNF-含量。 同时，OVW在体外或体内没有毒副作用。当OVW与葡糖胺（一种蛋白聚糖和糖蛋白，可减少培养的巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶的产生）结合时，这两种化合物协同作用以降低经LPS诱导的小鼠血清中TNF-水平。这些发现表明，OVW和氨基葡萄糖的组合可能是治疗多种炎症过程的有效方法，包括了类风湿性和骨关节炎等疾病。

关键词：橄榄、炎症、细胞因子、抗氧化剂

【中图分类号】R4             【文献标识码】A             【文章编号】2107-2306（2021）09--05

地中海饮食，因其富含水果、蔬菜和鱼类可大幅降低疾病发病率并改善整体健康状况 [1-3]。许多可通过地中海饮食影响、调整的疾病，包括癌症、糖尿病和心血管疾病中均含有炎症因子，或经炎症介质而发生恶化。伴随炎症而来的是活性氧 （ROS， reactive oxygen species）3 或自由基的产生，它们会增加蛋白质和脂质的氧化，从而产生引发更多炎症的信号。地中海饮食的健康益处归因于高浓度的清除自由基的简单多酚和类黄酮。橄榄果是此类饮食的主要组成部分，因其油成分（主要是油酸）和抗氧化酚类物质而对健康特别有益。

橄榄酚类物质在所有已知天然抗氧化剂中是具备最高的抗氧化活性的物质。橄榄酚类物质表现出抑制LDL氧化和血小板聚集、清除超氧化物和其他ROS、清除次氯酸、抑制中性粒细胞呼吸爆发并增加血浆抗氧化能力[4]。 羟基酪醇 （HT） 是一种在结构上与咖啡酸相关的橄榄酚类物质，显示可抑制自由基生成、清除活性氧和氮、抑制大鼠吸烟引起的氧化应激并提高血浆抗氧化能力[5-10]。

除了作为抗氧化剂的活性外，一些简单多酚类物质还显示出具有抗炎活性。例如，从红酒和红茶中提取的多酚化合物可调节细胞中的环氧合酶 2 （COX-2） 活性和 COX-2基因表达[11]。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是主要的绿茶多酚，可剂量依赖性地降低人巨噬细胞系中脂多糖（LPS）诱导的肿瘤坏死因子（TNF-）的产生[12]。在体内，给BALB/c小鼠服用绿茶多酚后，LPS诱导的血清TNF-降低了80% [12]。

在本研究中，研究了橄榄植物水 （OVW） 对LPS处理的人THP-1细胞和LPS处理的BALB/c小鼠的影响。葡萄糖胺是糖蛋白和蛋白聚糖的重要组成部分，在人体关节炎试验中具有疗效，也进行了相应评估。最后，测量OVW和葡糖胺对TNF-产生的联合作用，以确定这些化合物是否协同作用以减轻炎症症状。

材料与方法

试剂

RPMI培养基和胎牛血清 （FBS） 购自 GIBCO。TNF- ELISA试剂盒购自R&D Systems;3，4-二羟基苯基乙醇 （HT） 购自Cayman Chemical。橄榄苦苷购自Indofine Chemical，葡糖胺购自 Protein Research Labs。Trolox、1，1-二苯基-2-苦基肼、地塞米松 （DEX）、LPS 和 Folin 试剂购自Sigma。包括咖啡酸、没食子酸、酪醇、儿茶酚和原儿茶酸在内的标准品以及所有其他试剂均购自Sigma。

样品准备

在2000-2001作物年度收集的曼萨尼亚橄榄果实首先去核，然后无核果肉被机械压榨以产生液相混合物，包括橄榄油、植物水和固体。通过过滤和8000g离心40分钟从液相混合物中除去固体。油和水部分进行重力分离，并滗析水相。在经HPLC分析之前，OVW用1%柠檬酸处理6个月。对于体外和体内研究，OVW通过冷冻干燥，产生含有至少 6%多酚的浅棕色结晶产品（OVW特指OVW的冻干粉形式）。

酚类成分分析

将冻干的橄榄提取物以100 g/L的浓度重新懸浮在水中，并在Beckman-Coulter 125 NM 系列系统上通过HPLC对样品进行评估，该系统由 125 NM 系列泵、166 NMP 系列检测器和分析型 Ultrasphere 反相色谱柱（C-18;150 4.6 mm 内径）组成。如Romani等人所述，通过梯度洗脱实现分离[13]。使用Beckman 32 Karat软件收集和分析数据。通过在5个不同波长（220、240、280、320和340 nm）下分析标准品的保留时间和吸收来鉴定并确认化合物。通过将 OVW 中的HT与各种浓度纯HT的HPLC分析进行比较，确定该OVW中HT的浓度为 17 mg/g。

氧自由基吸收能力 （ORAC）

ORAC来评估 OVW、冻干OVW、橄榄油、橄榄叶和纯HT的抗氧化活性。 ORAC基本上按照Brunswick实验室Cao 等人的描述方法进行[14]。使用Trolox浓度和曲线下面积 （AUC） 之间的回归方程计算最终ORAC值，并表示为液体样品的mol Trolox当量/L或固体样品的当量/g。

THP细胞中的TNF-的测量

人单核细胞系THP-1从ATCC获得。 在细胞刺激处理前将OVW或HT添加到 96 孔微量滴定板中的THP-1细胞中预处理1小时，随后在37℃下用 LPS （10 g/L） 刺激细胞 3 小时。 LPS 刺激后，以200 g离心20分钟收集上清液，并通过ELISA评估 TNF-的水平。其中DEX （100 nmol/L，一种 TNF 释放抑制剂）用作阳性对照。

体内TNF-含量

小鼠 （Charles River Laboratories） 的处理遵守美国农业部动物福利法中概述的规定和 NRC指南中规定的条件。所有协议均经IACUC批准。至少每天观察小鼠的疾病或痛苦迹象。本研究中使用的小鼠是体重20–25g的未经产的非妊娠BALB/c小鼠。小鼠在接收和隔离3天后被安置在独立设施的专用房间中。初级围栏符合美国农业部动物福利法案（9 CFR，第 1、2和3部分）和 NRC 指南中的描述。小鼠被圈养4只/笼。房间通风（12次换气/小时），100%新鲜空气（无空气再循环）。保持12小时光：暗光周期，除非在黑暗周期打开室内灯以适应血液采样或其他研究程序。室温保持在18到26℃之间。在测试前允许小鼠自由进食和饮水。标准啮齿动物饮食（Prolab® RMH 2500;PMI Nutritional International）由24%的蛋白质、10.5%的脂肪、49%的碳水化合物、矿物质和维生素组成。实验前一天，小鼠禁食24小时。在禁食期结束时，给小鼠灌胃给予不同剂量的OVW或氨基葡萄糖或OVW氨基葡萄糖（“试验品”），让小鼠休息12小时。通过口服管饲法给对照小鼠喂水。在食物剥夺和治疗后期间，随意饮用水。OVW由约6-10%的多酚（3% HT）、65%的碳水化合物、20%的脂肪和 6%的蛋白质组成。 12小时后，通过口服强饲法给小鼠第二剂试验品。1小时后，他们通过腹腔注射LPS（50克水溶液）。在LPS治疗后2小时，根据美国兽医协会安乐死专家组的建议，在用异氟醚麻醉的情况下通过颈椎脱臼处死小鼠;通过眶后出血收集血液。血液在4℃下凝固12小时。血液凝固后，以 1000 g离心10分钟，然后收集血清用于通过ELISA测量TNF-水平。

协同作用的确认

为了确定OVW和氨基葡萄糖是否对LPS诱导的体内炎症具有协同作用，我们进行了先前描述的等值线分析 [15]。 对于该分析，获得了2个系列的剂量曲线。首先，使用固定浓度的OVW，生成抑制曲线;然后，使用固定浓度的氨基葡萄糖，生成另一组抑制曲线。确定每种化合物的85%有效剂量 （ED85） 值并用于绘制等效线图。OVW和氨基葡萄糖的组合产生的效果低于可加性线，表明具有协同作用。

统计分析

结果表示为至少 10 个独立测量的平均值SEM。 通过单向方差分析来分析数据以确定各组之间的显着差异，然后进行Dunnett后检验以将每个测试条件与LPS处理的细胞进行比较。 当P 0.05时，差异被认为是显着的。

实验结果

来自去核有机橄榄的营养水的组成

水解OVW的HPLC结果显示，4.7、9、12 和 29 分钟的主要保留峰分别对应于HT、酪醇、咖啡酸和橄榄苦苷（图 1），没有可检测到的儿茶酚、原儿茶酸或高香草酸，有时出现在“废水”中，或从压榨含有核的橄榄中获得的汁水[16-17]。 在较高波长下，复杂分子如橄榄苦苷、毛蕊花苷和肉桂酸衍生物很明显（结果未显示）;然而，这些分子在OVW中的浓度小于 HT总含量的10%;因此，检测到的最丰富的苯酚是HT。

抗氧化活性和酚类含量的比较。

与橄榄油相比，水性和冷冻干燥的OVW具有更多的总酚类物质和更好的氧自由基吸收能力（表1）。冷冻干燥橄榄水馏分（由11%的固体组成）导致总酚类物质的百分比增加>10 倍，同时ORAC活性也相应增加，这表明冷冻干燥不会损害馏分的活性。此外，最近表明，冷冻干燥是保持食品酚类完整性的首选方法（18）。橄榄油的HT和橄榄苦苷含量无法检测，而水性和冻干OVW的HT和橄榄苦苷的相对浓度分别为50%和11%（表1）。令人感兴趣的是，高度富含HT的OVW除抗氧化活性外是否还具有其他活性，以及HT是否有特别功效。

OVW降低THP-1细胞中的TNF-水平

为了检查 OVW 对炎症相关细胞因子表达的影响，我们首先评估了对TNF-在人类单核细胞系 THP-1 中产生。 相对于对照（仅 LPS 处理;图 2）OVW 显着降低TNF-含量。而HT则不影响TNF-的表达。

OVW降低小鼠体内TNF-的表达

为了确定上述发现是否适用于体内模型，我们评估了OVW在炎症小鼠模型中的作用。以35 mg OVW每只小鼠的劑量处理小鼠（1.4 g/kg;图 3），发现OVW 显着降低LPS诱导的TNF-的产生。在以125 mg OVW每只小鼠 （5 g/kg）的剂量条件下，TNF-表达量减少至少90%，没有观察到明显的毒性。上述实验结果表明OVW对体内TNF-的产生具备潜在的抑制效应。

氨基葡萄糖降低小鼠体内TNF-的表达

试验时，雌性 BALB/c小鼠在用LPS刺激前12小时和1小时通过口服管饲法给予不同浓度的氨基葡萄糖。 实验结果显示，氨基葡萄在6.2毫克/小鼠 （248毫克/千克）给药剂量下显著抑制LPS诱导的TNF-的产生，而在50毫克葡萄糖胺/小鼠给药剂量下完全抑制TNF-的产生（图 4）。

OVW与氨基葡萄糖通过协同作用保护小鼠免于经LPS诱导的体内TNF-的产生

OVW和氨基葡萄糖可以单独给药，也可以联合给药，其给药浓度均可达到预计产生阳性结果的浓度。实验结果显示所有的OVW和氨基葡萄糖组合均可抑制LPS诱导的小鼠体内TNF-的产生（图5）。实验比较了35 mg OVW和12.5 mg 葡糖胺单独使用与35 mg OVW + 12.5 mg葡糖胺组合对小鼠体内TNF-抑制的百分比，实验结果证实了OVW与葡糖胺联合使用后其抗炎效果是相叠加的，其抑制TNF-产生的百分比远大于通过将其中一种成分的浓度加倍使用所预测的抑制百分比。因此，橄榄提取物和氨基葡萄糖的组合比单独添加使用更具协同作用（图 6）。此外，还通过等效辐射分析以评估二者的协同作用（图 7）。在选取了两种化合物中的每一种的ED85值并检查了 OVW 和葡糖胺的可能协同作用。在OVW的ED85和单独的氨基葡萄糖的ED85获得的数据点之间绘制的直线预测了二者抑制TNF-产生的效果，如果2种化合物的组合产生累加效应则OVW 和氨基葡萄糖的组合低于该线，表明化合物之间存在协同相互作用。

讨论

在上述研究中，我们描述并分析了去核橄榄水解OVW的组成和活性。评估了OVW在LPS诱导的炎症小鼠模型中抑制TNF-产生的作用。我们发现以这种方式生产的橄榄水馏分具有独特的简单多酚的特征，与橄榄油和橄榄厂废水不同，其HT是主要的酚类组分。

羟基酪醇在体外和体内实验中均表现出有效的抗氧化、抗血栓形成和抗微生物能力。例如，HT被证明可以抑制自由基的产生，清除活性氧和氮，抑制大鼠吸烟引起的氧化应激，并增加血浆抗氧化能力[5-10]。HT还具有心脏保护活性，由于它可以抑制LDL氧化，可降低动脉粥样硬化的风险[1-20];抑制血栓形成时发生的血小板聚集[21];保护细胞免受在缺血和再灌注损伤期间发生的活性氧中间体而导致的细胞死亡[22];并抑制多种致病性革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的生长[23]。最后，在人体试验中，食用多酚含量高的橄榄油（特别是HT和酪醇）可呈剂量线性降低导致氧化的LDL含量，同时也可降低线粒体DNA中 8-oxo-7，8-dihydro-2-deoxyguanosine含量与尿丙二醛水平[24-25]。

在这项研究中，我们发现在一种关节炎模型中OVW显着降低了TNF-在经LPS处理的THP-1细胞中的含量。TNF-是该系统中诱导的主要细胞因子，并且是导致单核细胞炎症反应持续存在的细胞因子。有趣的是，OVW中存在的主要酚HT可减弱TNF-在这个细胞系统中生产。我们评估了纯HT在其他抗炎细胞模型中的有效性，发现它在这些模型中无效（未发表的结果）。因此，虽然水解橄榄水的主要酚类成分是 HT，但抗炎活性可能归因于水解产物的另一种尚未鉴定的成分。

为了确定OVW的有效性，我们在炎症的体内模型经LPS刺激处理的BALB/c小鼠体内测试了OVW的活性。先前的研究表明，其他简单多酚能够减轻或抑制由多种诱导剂引起的炎症反应。例如，红茶提取物被证明可以减弱内毒素诱导的体内白细胞介素IL-6的产生 [26]。 EGCG是绿茶提取物中的主要多酚，被证明可以抑制LPS诱导小鼠腹膜巨噬细胞体外和体内产生TNF-[12]。 EGCG抑制LPS诱导的TNF- mRNA 表达和核因子-kB（NF-kB）体外活性 [12，27]，表明存在可能的作用机制。此外，白藜芦醇表现出抑制TNF-诱导的NF-kB的激活[28]，同时也显著减弱 LPS 和佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯诱导的 COX-2 的表达[29]，并抑制NF-kB在小鼠皮肤和巨噬细胞中激活[30]。

我们发现通过口服强饲法给予小鼠OVW降低了经LPS处理后小鼠TNF-的产生。TNF-产生的减少是与OVW剂量呈线性相关，OVW其ED50值为75 mg/小鼠 （3 g/kg）。由于TNF-也是導致类风湿性关节炎 （RA） 相关的炎症发生的主要因素，我们想确定OVW是否可以与葡萄糖胺结合使用改善类风险关节炎中的相关炎症发生，葡萄糖胺已被证明在类风湿性关节炎中可以促进关节健康、减少破坏并增加组织的重建。

氨基葡萄糖被认为通过促进关节基质来保护关节免受炎症和身体接触引起的破坏，也被证明具有一定的抗炎活性。N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖，被证明在人类关节软骨细胞中可以抑制IL-1诱导的NO产生 [31]。抑制诱导型一氧化氮合酶mRNA和蛋白质表达从而产生抑制作用。N-乙酰氨基葡萄糖，但非氨基葡萄糖，也抑制了IL-1诱导的COX-2和IL-6的产生。

文章首次证明了OVW和葡糖胺均可有效抑制经LPS诱导的TNF-的产生的，以及OVW 与葡糖胺可协同抑制LPS诱导的细胞因子的产生。二者联合的优点包括通过降低目标疗效所需的葡萄糖胺剂量来提高安全性，并降低潜在副作用。同时，即使在非常高的剂量下，OVW也没有副作用 [32]。因此，OVW被证明是一种有效的节省剂量的化合物，不仅适用于氨基葡萄糖，而且适用于其他抗炎化合物和药物。

参考文献：

[1]Keys， A. （1980） Wine， garlic， and CHD in seven countries. Lancet 1： 145–146.

[2]Ferro-Luzzi， A. & Sette， S. （1989） The Mediterranean diet： an attempt to define its present and past composition. Eur. J. Clin. Nutr. 43 （suppl. 2）： 13–29.

[3]Trichopoulou， A.， Costacou， T.， Bamia， C. & Trichopoulos， D. （2003） Adherence to a Mediterranean diet and survival in a Greek population. N. Engl. J. Med. 348： 2599–2608.

[4]Visioli， F.， Poli， A. & Gall， C. （2002） Antioxidant and other biological activities of phenols from olives and olive oil. Med. Res. Rev. 22： 65–75.

[5]Lavelli， V. （2002） Comparison of the antioxidant activities of extra virgin olive oils. J. Agric. Food Chem. 50： 7704–7708.

[6]Stupans， I.， Kirlich， A.， Tuck， K. L. & Hayball， P. J. （2002） Comparison of radical scavenging effect， inhibition of microsomal oxygen free radical generationand serum lipoprotein oxidation of several natural antioxidants. J. Agric. Food Chem. 50： 2464–2469.

[7]Owen， R. W.， Giacosa， A.， Hull， W. E.， Haubner， R.， Spiegelhalder， B. & Bartsch， H. （2000） The antioxidant/anticancer potential of phenolic compounds isolated from olive oil. Eur. J. Cancer 36： 1235–1247.

[10] Visioli， F.， Bellomo， G. & Galli， C. （1998） Free radical-scavenging properties of olive oil polyphenols. Biochem. Biophys. Res. Commun. 247： 60–64.

[11] de la Puerta， R.， Martinez Dominguez， M. E.， Ruiz-Gutierrez， V.， Flavill， J. A. & Hoult， J. R. （2001） Effects of virgin olive oil phenolics on scavenging of reactive nitrogen species and upon nitrergic neurotransmission. Life Sci. 69： 1213–1222.

[12] Visioli， F.， Galli， C.， Plasmati， E.， Viappiani， S.， Hernandez， A.， Colombo， C. & Sala， A. （2000） Olive phenol hydroxytyrosol prevents passive smokinginduced oxidative stress. Circulation 102： 2169–2171.

[13] Luceri， C.， Caderni， G.， Sanna， A. & Dolara， P. （2002） Red wine and black tea polyphenols modulate the expression of cycloxygenase-2， inducible nitric oxide synthase and glutathione-related enzymes in azoxymethane-induced f344 rat colon tumors. J. Nutr. 132： 1376–1379.

[14] Yang， F.， Oz， H. S.， Barve， S.， de Villiers， W. J.， McClain， C. J. & Varilek， G. W. （2001） The green tea polyphenol （-）-epigallocatechin-3-gallate blocks nuclear factor-kappa B activation by inhibiting I kappa B kinase activity in the intestinal epithelial cell line IEC-6. Mol. Pharmacol. 60： 528–533.

[15] Romani， A.， Mulinacci， N.， Pinelli， P.， Vincieri， F. F. & Cimato， A. （1999） Polyphenolic content in five Tuscany cultivars of Olea europaea L. J. Agric. Food Chem. 47： 964–967.

[16] Cao， G.， Giovanoni， M. & Prior， R. L. （1996） Antioxidant capacity in different tissues of young and old rats. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 211： 359–365.

[17] Bednarski， J. J.， Lyssiotis， C. A.， Roush， R.， Boitano， A. E.， Glick， G. D. & Opipari， A. W.， Jr. （2004） A novel benzodiazepine increases the sensitivity of B cells to receptor stimulation with synergistic effects on calcium signaling and apoptosis. J. Biol. Chem. 279： 29615–29621.

[18] Visioli， F.， Vinceri， F. F. & Galli， C. （1995） ‘Waste waters’ from olive oil production are rich in natural antioxidants. Experientia 51： 32–34.

[19] Mulinacci， N.， Romani， A.， Galardi， C.， Pinelli， P.， Giaccherini， C. & Vincieri， F. F. （2001） Polyphenolic content in olive oil waste waters and related olive samples. J. Agric. Food Chem. 49： 3509–3514.

[20] Asami， D. K.， Hong， Y. J.， Barrett， D. M. & Mitchell， A. E. （2003） Comparison of the total phenolic and ascorbic acid content of freeze-dried and air-dried marionberry， strawberry， and corn grown using conventional， organic， and sustainable agricultural practices. J. Agric. Food Chem. 51： 1237–1241.

[21] Grignaffini， P.， Roma， P.， Galli， C. & Catapano， A. L. （1994） Protection of low-density lipoprotein from oxidation by 3，4-dihydroxyphenylethanol. Lancet 343： 1296–1297.

[22]Visioli， F. & Galli， C. （2001） Antiatherogenic components of olive oil. Curr. Atheroscler. Rep. 3： 64–67.

[23] Petroni， A.， Blasevich，M.， Salami，M.， Servili，M.，Montedoro， G. F. & Galli， C. （1994） A phenolic antioxidant extracted from olive oil inhibits platelet aggregation and arachidonic acid metabolism in vitro. World Rev. Nutr. Diet. 75： 169–172.

[24] Manna， C.， Galletti， P.， Cucciolla， V.， Moltedo， O.， Leone， A. & Zappia， V. （1997） The protective effect of the olive oil polyphenol （3，4-dihydroxyphenyl）- ethanol counteracts reactive oxygen metabolite-induced cytotoxicity in Caco-2 cells. J. Nutr. 127： 286–292.

[25] Bisignano， G.， Tomaino， A.， Lo Cascio， R.， Crisafi， G.， Uccella， N. & Saija， A. （1999） On the in-vitro antimicrobial activity of oleuropein and hydroxytyrosol. J. Pharm. Pharmacol. 51： 971–974.

[26] Weinbrenner， T.， Fito， M.， de la Torre， R.， Saez， G. T.， Rijken， P.， Tormos， C.， Coolen， S.， Albaladejo， M. F.， Abanades， S.， Schroder， H.， Marrugat， J. & Covas， M. I. （2004） Olive oils high in phenolic compounds modulate oxidative/ antioxidative status in men. J. Nutr. 134： 2314–2321.

[27] Marrugat， J.， Covas， M. I.， Fito， M.， Schroder， H.， Miro-Casas， E.， Gimeno， E.， Lopez-Sabater， M. C.， de la Torre， R. & Farre， M. （2004） Effects of differing phenolic content in dietary olive oils on lipids and LDL oxidation–a randomized controlled trial. Eur. J. Nutr. 43： 140–147.

[28] Amarakoon， A. M.， Tappia， P. S. & Grimble， R. F. （1995） Endotoxin induced production of interleukin-6 is enhanced by vitamin E deficiency and reduced by black tea extract. Inflamm. Res. 44： 301–305.

[29] Lin， Y. L. & Lin， J. K. （1997） （-）-Epigallocatechin-3-gallate blocks the induction of nitric oxide synthase by down-regulating lipopolysaccharide-induced activity of transcription factor nuclear factor-kappaB. Mol. Pharmacol. 52： 465–472.

[30] Manna， S. K.， Mukhopadhyay， A. & Aggarwal， B. B. （2000） Resveratrol suppresses TNF-induced activation of nuclear transcription factors NF-kappa B， activator protein-1， and apoptosis： potential role of reactive oxygen intermediates and lipid peroxidation. J. Immunol. 164： 6509–6519.

[31] Martinez， J. & Moreno， J. J. （2000） Effect of resveratrol， a natural polyphenolic compound， on reactive oxygen species and prostaglandin production. Biochem. Pharmacol. 59： 865–870.

[32] Surh， Y. J.， Chun， K. S.， Cha， H. H.， Han， S. S.， Keum， Y. S.， Park， K. K. & Lee， S. S. （2001） Molecular mechanisms underlying chemopreventive activities of anti-inflammatory phytochemicals： down-regulation of COX-2 and iNOS through suppression of NF-kappa B activation. Mutat. Res. 480–481： 243–268.

[33] Shikhman， A. R.， Kuhn， K.， Alaaeddine， N. & Lotz， M. （2001） NAcetylglucosamine prevents IL-1 beta-mediated activation of human chondrocytes. J. Immunol. 166： 5155–5160.

[34] Christian， M. S.， Sharper， V. A.， Hoberman， A. M.， Seng， J. E.， Fu， L.， Covell， D.， Diener， R. M.， Bitler， C. M. & Crea， R. （2004） The toxicity profile of hydrolyzed aqueous olive pulp extract. Drug Chem. Toxicol. 27： 309–330.