核酸检测用PCR仪设计和测试方法

郑镇钦

摘要：核酸检测用PCR仪通过对未知模板进行定量分析，具有操作简便、快速高效、特异性强、灵敏度高等优点，该技术在核酸定量分析和分子诊断等医学领域应用十分广泛。本文重要介绍PCR仪的设计和测试方法。

关键词：PCR、设计方法、测试方法

一、荧光PCR工作站应用领域

分子生物学研究：对传染性疾病进行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的检测，比如新型新型冠状病毒SARS-CoV-2导致的新冠肺炎（COVID-19）的检测等。

医学领域研究：采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。

二、荧光PCR工作站的基本原理

荧光共振能量转移原理是当一个荧光分子（供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（受体分子）的激发光谱重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。Ct值是实时荧光PCR中一个很关键的因素，C代表循环（Cycle），t代表阈值（Threshold）。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线。

实时荧光PCR工作站是基于荧光PCR技术的全自动化一体化仪器，设计的核心是PCR模块。

三、PCR模块的功能设计

1.高速升降温度功能：通过快速升降温完成聚合酶连锁反应;

2.荧光读取功能：在PCR过程中实现对荧光信号的读取;

3.通信功能：模块提供下位机软件、电路接口，实现外部软件对模块的控制、数据读取。

四、PCR管的选择

由于PCR的核心指标是升温速率、降温速率、模块温度均匀性等，因此，PCR管容积越小，越有利于升降温。尽管目前主要使用的PCR管有0.2mL透明單管、0.1mL透明单管、0.2mL透明八联管、0.2mL白色八联管、0.1mL透明八联管、0.1mL白色八联管等等，但我们仍然主张要进一步越小容积方向发展，应以微升级为目标，例如先进一步缩小至70μL。同时，为更有利于荧光扫描，PCR应尽量选用透明度高的材质。

五、PCR模块的结构和设计

PCR模块的每一个单元，应采用独立的升降温组件，每个升降温组件可容纳1个PCR管，PCR管可以是6联管或者8联管，或者其他规格。升降温组件采用帕尔贴进行温度控制，散热采用水冷方式，帕尔贴加水冷散热的组合方式使得PCR反应速度更快、温度控制更精准。

主要组件有：

升降温组件：每个组件搭载3个帕尔贴，可对模块进行精确控温以及快速升降温;

水冷组件：采用水冷泵供给制冷液，可快速对帕尔贴进行降温散热，加快PCR反应速率;

运动组件：带动扫描头组件运动，快速对PCR管进行侧扫描;

扫描头组件：对PCR管进行扫描，检测PCR管内荧光信号值;

加热模块压紧件：压紧模块，使模块与帕尔贴充分贴合，增强热传导速率。压紧件采用聚醚醚酮材料加工;

加热模块：承载PCR管，同时为PCR管均匀传导热能。加热模块采用6063材料加工;

温度保险：为升降温组件提供温度保护。温度保险采用130℃、3A熔断式温度保险，可保证仪器安全;

帕尔贴：进行升降温控制。每个加热模块下布置1-3个帕尔贴，使得加热速度更快，均一性更好。

水冷组件：由水冷仓组件、水冷排组件、水冷泵组件和水冷管路组成。

六、PCR性能的测试方法

1.平均升温速率的测试方法

获得45℃（恒温2min）->95℃（恒温2min）循环的一组数据。取50℃±0.5℃范围内一温度点，温度记为Ta，取90℃±0.5℃范围内一温度点，温度记为Tb，从Ta到达Tb的时间记为t。按公式计算平均升温速率：平均升温速率=（Tb-Ta）/t。平均升温速率温度从50℃±0.5℃升至90℃±0.5℃，平均升温速率应≥1.5℃/s。

2.最大升温升温速率的测试方法

设置温度采集时间间隔为Δt，Δt≤1s并尽可能足够小，扫描温度从50℃±0.5℃升至90℃±0.5℃过过程中的瞬时最大温度变化ΔTmax。按如下公式计算最大升温速率：最大升温速率=ΔTmax/Δt。温度从50℃±0.5℃升至90℃±0.5℃，最大升温速率应≥2.5℃/s。

平均降温速率和最大降温速率同理测试。

3.控温精度

获得55℃（恒温2min）->72℃（恒温2min）->95℃（恒温2min），且循环5次的温度数据。取55℃、72℃、95℃三个温度点，当测试温度到达设定温度后恒温10s后（即当温度稳定后），计时30s。记录30s内的最高温度和最低温度，计算二者差值的一半ΔTn（n为5个循环），并取ΔTn的最大值Max（ΔTn）。Max（ΔTn）应≤0.5℃。

4.温度准确度

获得55℃（恒温2min）->72℃（恒温2min）->95℃（恒温2min），且循环5次的温度数据。取55℃、72℃、95℃三个温度点，当测试温度到达设定温度后恒温10s后（即当温度稳定后），计时60s，每10s记录一次温度数据，即60s内共记录6个温度数据Ti（i=1～6），求Ti的平均值Tm。Tm与设定温度差值的绝对值应≤0.5℃。

5.温度均匀性

获得55℃（恒温2min）->72℃（恒温2min）->95℃（恒温2min），且循环5次的温度数据。取55℃、72℃、95℃三个温度点，当测试温度到达设定温度后恒温10s后（即当温度稳定后），计时60s，记录温度数据Ti（Ti=1，2，…n），在模块上随机或均匀选取n（n≥6）个孔位，取Ti最大与最小值，计算各孔位的温度差值ΔT。各孔位（孔位需≥6）的温度差值ΔT应在±1℃范围内。

6.温度持续时间准确度

以95℃±0.5℃为计时参考点，自显示温度首次到达计时参考点，计时开始;至末次到达计时参考点结束，记录时间为tn（n=1～5，为循环数），并计算5个循环记录时间的平均值tm。按下列公式计算相对偏差：相对偏差=（tm-t）/tx100%。

总结：聚合酶链式反应（PCR）是分子生物学里程碑式的巨大成就，而荧光定量PCR的发展，又具有飞跃式的巨大进步。因此，基于荧光定量PCR工作站的PCR设计和测试技术研究，是对人类生命健康具有重要意义的研究方向。

参考文献：

[1]凯普企业工业设计中心荧光PCR工作站项目