艾曲泊帕乙醇胺的微生物限度检查方法适用性研究

段春艳 王以云 王秀艳 胡文红

摘要：目的：探讨艾曲泊帕乙醇胺最合适的微生限度检查的方法。方法：采用2020版《中国药典》<1105非无菌产品微生物限度检查法>中的微生物计数法中的薄膜过滤法和平皿法相结合的方法进行验证。结果：在验证条件下，该方法能消除供试品对微生物生长的抑制作用。结论：该方法准确可靠，可用于艾曲泊帕乙醇胺的微生物计数法的检测。

关键词：微生物计数法;艾曲泊帕乙醇胺;方法验证

中图分类号： 文献标识码：A

艾曲波帕乙醇胺可用于治疗经糖皮质激素类药物、免疫球蛋白治疗无效或脾切除术后慢性特发性血小板减少性紫（ITP）患者的血小板减少。该药作为ITP二线治疗的优选方案，不仅可快速提升血小板数量，便利的口服方式改变了过去以注射为主的治疗方式，提升了患者的用药依从性。

1 材料

（1）仪器与设备 六联支架过滤装置（赛多利斯），无菌滤膜（赛多利斯），培养箱（德国宾得），BSC-1304ⅡA2生物安全柜（苏净安泰）。

（2）试剂

培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、 沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）。

稀释液：PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液、中和剂（含3%吐温80、0.3%卵磷脂、1%皂素的PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液）、含5%吐温的PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液。

实验菌种：铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，均由中国食品药品检定研究院提供。

2 方法适用性试验

2.1 菌液的制备

取保存在TSA斜面培养基上的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的培养物适量接种至10 mL 的TSB培养基内，置30～35℃培养18～24小时。取保存在SDA斜面培养基上的白色念珠菌培养物适量接种至10 mL 的SDB培养基中，20～25℃培养2～3天. 取保存在SDA斜面培养基上的黑曲霉培养物至SDA斜面培养基上，20～25℃培养5～7天，加入含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，取上述均匀培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液梯度稀释制成适宜浓度的菌悬液。

2.2艾曲泊帕乙醇胺的微生物计数法验证过程

<试验一>

供试液的制备A组：称取供试品8克，加入80ml PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，制成1：10的供试液，再取1：10的供试液50ml，加入50ml的PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，制成1;100的供试液。

供试液的制备B组：用中和剂代替PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，其他操作同A组。

试验组：取1;100的供试液每瓶9.9毫升进行等量分装，分别加入0.1ml铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液混匀（使每1ml的供试液中含菌量不大于100cfu），取1ml含菌液的供试液置平皿中，倾注15-20ml温度不超过45度的TSA培养基，于30-35度培养不超过3天，计数。

菌液对照组：取pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9ml/瓶代替供试液，加入0.1ml上述菌液，同试验组操作培养，进行菌液计数。

供試品对照组：取1：100供试液1ml，分别置无菌平皿中，注入胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，待凝固后，32.5℃倒置培养不少于3天进行需氧菌总数的计数;取1：50供试液1ml，分别置无菌平皿中，注入沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，待凝固后，22.5℃倒置培养不少于5天进行霉菌和酵母菌总数的计数，测定供试品本底菌数。

阴性对照组：取pH6.8磷酸盐缓冲液1ml，按供试品组操作，进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。方法学验证结果：

方法适用性试验结果汇总 培养基 阳性菌 阳性菌数 供试品阳性（A组） 供试品阳性（B组）

通过试验一可得知用pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和用中和剂溶解样品的回收率都差不多，中和剂也不能消除它的抑菌性，用时也得知配制的1：50的供试液，对白色念珠菌和黑曲霉的抑制性已消除，1;100的供试液对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌抑制性未消除，因此用PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液扩大到1：500倍，再次验证回收率。

方法学验证结果：

3 结论与讨论

（1）经验证取供试品，用PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液溶解并制成1：10的供试液，再用PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释得到1：50的供试液和1：100的供试液，取1：100的供试液稀释静止10分钟，取上清液1ml，采用薄膜过滤法，用PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗5次（每次100ml），进行艾曲泊帕乙醇胺需氧菌总数的计数，取1：50的供试液1ml，用平皿法进行艾曲泊帕乙醇胺霉菌及酵母菌总数的计数，方法学验证合适。

（2）讨论

艾曲泊帕乙醇胺的需氧菌总数的限制为103cfu，可接受的最大菌数为2000，如果用1：1000的供试液检测，置信度偏低，可采用薄膜过滤法进行需氧菌总数的检测。因此该方法适用于艾曲泊帕乙醇胺的微生物限度需氧菌总数的检查。

参考文献：

[1]吴伟平，陈宇堃，梁蔚阳，余燕.他克莫司胶囊微生物限度检查方法的建立[J].中国药瓶标准，2020，

[2]中华人民共和国药典2020年版.四部1105：164