纤溶酶原核表达及功能分析

强萌萌，伍丽娜，宋翔，方旭东，李钒

（天津渤海职业技术学院，天津300402）

目前，普遍将能够专一性降解纤维蛋白凝胶的蛋白水解酶称为纤溶酶（plasmin）。在人类或者动物体内具有凝血和纤溶两个系统，它们的存在是相互关联的，功能上是互相依托的，[3]。众所周知，当机体由于某种原因发生了凝血反应后，几乎是与此同时往往激活机体的纤溶系统，导致体内多余的血栓发生迁移，机体出现负反馈效应降低体内纤维蛋白原的水平，避免出现纤维蛋白的过多凝聚的现象[4],激活的纤溶酶可降解纤维蛋白和纤维蛋白原。目前，纤溶酶是首个直接作用于血栓前体蛋白的降纤药[5]。同时，目前市售的纤溶酶制品的生产原料的来源大部分为动物血浆,这类纤溶酶产品在使用上不仅可能会引起人体的异源性免疫反应还具有传播动物疾病的风险。基于这种现状，我们认为即安全又大量的生产纤溶酶迫在眉睫[6]。因此，我们利用所学知识认为应当制备人源纤溶酶用于生产。本论文利用生物技术、分子生物学、基因工程和化学工程技术等实现纤溶酶在原核中的表达，同时进行体外培养的研究、进行了生产纤溶酶的可行性研究，取得了一定研究成果,这些将成为未来纤溶酶制备的一个新的发展方向,在现代生物化工产业中具有良好的前景。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

新鲜混和血浆由天津市血液中心提供；PCR仪（美国Bio-Rad Laboratories公司）；核酸蛋白分析仪（美国Bio-Rad Laboratories公司）；GeneGenius全自动凝胶成像系统（Syngene公司）；752N型紫外可见光分光光度计：上海精研；CR21G高速冷冻离心机（日本HITACHI公司）；PET-40b载体（载体质粒为Promega生物技术有限公司）；T4 DNA连接酶(Ta-KaRa公司)；BamHⅠ(TaKaRa公司)XhoⅠ(TaKaRa公司)；Bl-21大肠杆菌（sigma公司产品）；细胞培养板:为NUNC公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 纤溶酶因子RNA的提取

采集人体血样，从人体血样中提取人源RNA。

1.2.2 cDNA的获取

将上述提取的人源RNA进行逆转录，获取纤溶酶表达基因的cDNA。

1.2.3 PCR反应

在NCBI基因组数据库中查到的人源的纤溶酶序列，提取所需的cDNA，以其为模板利用PCR（聚合酶连接技术）扩增纤溶酶的基因。琼脂糖凝胶电泳检测扩增基因产物后，进行切胶回收[7]。

1.2.4 双酶切反应

PCR产物双酶切体系，将PCR回收产物进行双酶切反应为：质粒 15uL、ddH2O6uL、10×Tango buffer6uL、BamHI(10U/uL)1.5uL、XhoI(10U/uL)1.5uL、总计30uL。

1.2.5 连接反应

根据需要通过一系列的对比研究选取了PET-40b为载体，pET-40b质粒（见图1）表达载体为原核生物高效表达载体。在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为10μL。质粒载体：2uL，10×T4 buffer：1uL，T4 连接酶：1uL，目的片段：6uL，总计10uL。16℃，2～4h后，放入4℃冰箱中过夜。

1.2.6 转化

重组子转化E.coli BL21：制备一定量的E.coli BL21感受态细胞，分装为100μL每只待用。

将需要的目的连接产物转化入前期制备完成的100μL感受态大肠杆菌中，均匀涂布于LB固体培养基上（含有抗生素Kan 100μg/mL）表面，待包含目的产物的感受态细胞充分渗入培养基后，放于37℃中培养 12h[8]。

1.2.7 验证

提取相关质粒后分别进行双酶切以及DNA测序验证。

图1 pET-40b质粒图谱

1.2.8 最佳诱导条件的确定

对转入的重组E.coli BL21进行扩培，接菌量为1%，并加入0.1%的Kan，以5mL为一样品量在LB培养基中进行培养。收集菌体后破碎菌体，离心收集沉淀，于100℃下煮沸10min。置于4℃下保存[9]。

1.2.9 镍柱法纯化融合蛋白

因为在pET-40b载体上带有His-Tag，因此可采用固定金属离子亲和色谱法（IMAC）去纯化融合蛋白。

1.2.10 样品准备

收集培养发酵液，用超声探头将混合菌体在冰水中进行破碎。

1.2.11 酶活的测定

纤维蛋白平板法验证产物活性将经蛋白质凝胶电泳分析后分子量与目的产物相同的菌株扩大培养后，收集菌体，超声破碎，得到蛋白上清。在事先准备好的纤维蛋白平板上用打孔器进行打孔，加入蛋白上清和1标准品10μL，37℃下培养12h，观察溶栓圈[11]。

2 试验结果

2.1 扩增目的片段

图2 PCR产物凝胶电泳分析

图3 质粒提取凝胶电泳分析分析

图4 酶切凝胶电泳分析

2.2 纤溶酶酶活力测定标准曲线的绘制（见图5）

2.3 酶促反应温度的选择（图6）

图6 反应温度对纤溶酶酶活的影响

由图6可见，当温度为35℃时，纤溶酶的酶活最高，为37.69 U/mg蛋白。

3 讨论

通过相关生物工程技术进行研究的过程是首先将需要的目的基因利用DNA重组技术连接在特定的载体上，随后将连接成功的目的性产物导入到相应的靶细胞（微生物，动物细胞、人体细胞、昆虫细胞、植物细胞），实现在选定的靶细胞内表达目的基因的目的，最后将研究所得的需要表达的目的蛋白质进行提纯，从而实现目的基因的体外表达[12]，进而投入生产应用。

通过以上实验我们发现，纤溶酶可以在大肠杆菌中实现表达，进而进行体外培养。在国外的研究领域已开展了相关生物工程和化学工程的方法来制备纤溶酶的研究,这是未来制备纤溶酶的一个新思路和新方向。

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