反相高效液相色谱法测定硫酸沙丁胺醇片和气雾剂中沙丁胺醇的含量

刘进芳，马艳，刘苇

(1.天津卓远达贸易有限公司，天津300457；2.重庆市计量质量检测研究院，重庆401121；3.天津华北地质勘探局，天津300181)

反相高效液相色谱法测定硫酸沙丁胺醇片和气雾剂中沙丁胺醇的含量

刘进芳1，马艳2，刘苇3

(1.天津卓远达贸易有限公司，天津300457；2.重庆市计量质量检测研究院，重庆401121；3.天津华北地质勘探局，天津300181)

在Shim-pack VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm，4.6 μm)上进行分离，以0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液－乙腈(体积比为85∶15)为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为225 nm，柱温为40℃，建立了反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定硫酸沙丁胺醇片和气雾剂中沙丁胺醇含量的方法。结果显示：沙丁胺醇在0.5～20 μg/mL浓度范围内线性关系良好，线性相关系数为0.9988，RSD为3.21%(n=6),硫酸沙丁胺醇片和气雾剂的回收率分别为105.69%和91.62%。利用此方法测定硫酸沙丁胺醇片和气雾剂中沙丁胺醇的含量，具有方法简便、快速、准确可靠的优点，可以作为沙丁胺醇药物制剂的含量测定和质量控制。

反相高效液相色谱法(RP-HPLC)；沙丁胺醇；硫酸沙丁胺醇片；沙丁胺醇气雾剂

沙丁胺醇(Salbutamol)，又名舒特灵，化学名为1-(4-羟基-3-羟甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇(1-(4-Hydroxy-3-hydroxymethylphenyl)-2-tertbutylaminol ethanol)，其结构式如下：

沙丁胺醇是人工合成的肾上腺素β2受体兴奋药之一，属于水杨醇类的肾上腺素激动药。它对肾上腺素β2受体有高度选择性，具有较强的支气管扩张作用，临床上多用于治疗哮喘性支气管炎、支气管哮喘、肺气肿引起的支气管痉挛等疾病。制剂一般用其硫酸盐，为白色粉末。硫酸沙丁胺醇首先由英国Allen&Hanburys公司于1969年研究开发并以Vent Olin商品名在德、法两国上市，是临床上治疗哮喘的一线药物[1]。目前，用于临床的主要剂型有片剂、胶囊、注射液和喷雾剂。由于口服的沙丁胺醇在人体内吸收速度快，半衰期为2.7～5 h，作用仅维持5 h[2]，所以近年来多用其喷雾剂和缓释胶囊制剂。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器:日本岛津（SHINADZU）LC-10A高效液相色谱仪系统：DGU-14A在线脱气机，LG-10AT四元梯度泵，CTO-10A柱温箱，SPD-M10A二极管阵列检测器，CLASS-VP色谱工作站，SCL-10A控制器，SB2200超声波发生器（上海必能信超声有限公司），Milli-Q纯水器（Millipore公司）；HANGPING FA2004电子天平（上海天平仪器厂）；25 μL微量进样器（日本岛津公司）；微量移液器（上海荣泰生化工程有限公司）；0.45 μm微孔过滤器。

试剂:乙腈（色谱纯，天津市福晨化学试剂厂）；磷酸（分析纯，天津市河东区红岩试剂厂）；磷酸二氢钾（分析纯，天津市河东区红岩试剂厂）；沙丁胺醇对照品（中国药品生物制品检定所）；硫酸沙丁胺醇片（天津力生制药股份有限公司，产品批号0509006）；沙丁胺醇气雾剂（蓬莱诺康药业有限公司，产品批号071118）；配制试剂用水均为Milli-Q纯水器处理的超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱为Shim-pack VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm，4.6 μm)；保护柱为Shim-pack GVP-ODS(5 μm，4.6×10 mm)；流动相为0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液-乙腈（体积比为85∶15）；流速为1.0 mL/min；检测波长为225 nm；进样量为20 μL；柱温为40℃。

1.2.2 应用试剂的配制

流动相的配制：精确称取0.6805 g的磷酸二氢钾固体于小烧杯中，用超纯水溶解，引流至500 mL的容量瓶中定容，配制成0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液，再用0.45 μm微孔过滤膜过滤。

1.2.3 标准储备液的配制

精确称取沙丁胺醇标准品0.0205 g于10 mL的比色管中，用二次蒸馏水稀释并定容至10 mL，配制成2 mg/mL的标准储备液，测定时取上述标准储备液配制成适宜浓度的标准工作溶液。

1.2.4 样品溶液的配制

取硫酸沙丁胺醇三片(约相当于沙丁胺醇6 mg)，精密称定0.1951 g，研细，精密称取0.0071 g，置于10 mL比色管中，加流动相适量，振摇使硫酸沙丁胺醇溶解，用流动相稀释并定容至10 mL刻度，摇匀，过滤，配制成23 μg/mL的样品溶液，进行测定。

取沙丁胺醇气雾剂100 μL于10 mL比色管中，用流动相稀释并定容至10 mL刻度，配制成19 μg/ mL的样品溶液，进行测定。

2 结果与讨论

2.1 分离条件的选择与优化

2.1.1 检测波长的选择

取20 μL 20 μg/mL的沙丁胺醇标准溶液进样，流速为1.0 mL/min。结果显示：当检测波长小于225 nm时，溶剂峰较大，干扰大，影响测定的灵敏度；当检测波长大于225 nm时，沙丁胺醇的灵敏度较低；在225 nm处，沙丁胺醇有较灵敏的响应，且干扰小、分离效果佳，便于检测，因此选择225 nm作为检测波长。

2.1.2 流动相的选择

本文分别试验了用水-甲醇、水-乙腈、水（0.01 mol/L NH4Ac-HAc缓冲溶液）-乙腈、水（0.01 mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲溶液）-乙腈等体系作为流动相测定沙丁胺醇的含量，结果表明：当用水-甲醇、水-乙腈及水（0.01 mol/L NH4Ac-HAc缓冲溶液）-乙腈时，沙丁胺醇色谱图的峰形差，保留时间欠佳；但用水（0.01 mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲溶液）-乙腈时，沙丁胺醇色谱图的峰形好，保留时间最佳，故选择水（0.01 mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲溶液）-乙腈体系作为流动相。并且考察了0.01 mol/L KH2PO4-H3PO4（pH 4.0）缓冲溶液和乙腈不同配比时对沙丁胺醇保留时间的影响，结果如表1。

从表1可以看到，随着流动相中乙腈的比例增加，沙丁胺醇的保留时间逐渐减少。当乙腈占总流动相体积的30%时，虽然沙丁胺醇的出峰时间提前，但与溶剂出峰接近，彼此有干扰；当流动相中乙腈与KH2PO4-H3PO4缓冲溶液的比例为15∶85时，沙丁胺醇的出峰时间最为理想，它受杂峰干扰少，故流动相配比可选为15∶85，如图1所示。

表1 流动相配比和酸度对保留时间的影响

图1 乙腈比例对保留时间的影响

反相烷基键合的稳定性与使用流动相的pH值相关，通常水溶液的pH应保持在2～8之间，pH＞8.50会引起基体硅胶的溶解。本文考察了流动相的pH值对沙丁胺醇保留时间的影响，结果见表1。从表1可以看出，pH在2.80～5.00时，虽然沙丁胺醇的保留时间变化很小，但从沙丁胺醇的标准色谱图（图3）中显示，在此pH范围内，沙丁胺醇的出峰位置随pH减少与杂峰距离增大，受杂峰干扰减少，尤在pH为3.80时，溶剂峰的干扰最小。因此，综合考虑，确定流动相的pH为3.80，如图2所示。

图2 pH值对保留时间的影响

2.2 精密度试验

在最佳色谱条件下，用浓度为10 μg/mL的沙丁胺醇标准溶液日内连续进样6次，每次进样20 μL，以峰面积计算得沙丁胺醇的相对标准偏差（RSD）为3.21%。

2.3 方法的线性关系与检出限

取适宜浓度的标准储备液，用流动相稀释并定容于10 mL比色管中，配制成浓度分别为0.01 μg/ mL、0.04 μg/mL、0.1 μg/mL、0.4 μg/mL、1 μg/mL、20 μg/mL的沙丁胺醇标准溶液，每种溶液分别进样3次，以峰面积对浓度作沙丁胺醇的标准工作曲线，用稀释法测定沙丁胺醇的检出限。沙丁胺醇的标准工作曲线如图3，其线性范围、线性回归方程、相关系数、检出限列于表2，其中X表示沙丁胺醇的质量浓度，Y表示沙丁胺醇的峰面积。

表2 沙丁胺醇的回归分析结果及线性范围

图3 沙丁胺醇标准曲线

2.4 加标回收试验

移取三份硫酸沙丁胺醇片样品溶液100 μL于三支10 mL的比色管中，分别向其中加入2 mg/mL沙丁胺醇标准溶液50 μL、100 μL和200 μL，用流动相稀释并定容至10 mL刻度线。

移取三份沙丁胺醇气雾剂样品溶液100 μL于三支10 mL的比色管中，分别向其中加入2 mg/mL沙丁胺醇标准溶液各50 μL、100 μL和200 μL，用流动相稀释并定容至10 mL刻度线。在最佳色谱条件下进样(进样量为20 μL),做加标回收试验，回收率见表3，图4和图5分别为硫酸沙丁胺醇片和气雾剂样品的加标色谱图。

2.5 样品测定

取硫酸沙丁胺醇三片(约相当于沙丁胺醇6 mg)，精密称定0.1951 g，研细，精密称取0.0071 g，置于10 mL比色管中，加流动相适量，振摇使硫酸沙丁胺醇溶解，用流动相稀释并定容至10 mL刻度。

取沙丁胺醇气雾剂100 μL于10 mL比色管中，用流动相稀释并定容至10 mL刻度。

表3 硫酸沙丁胺醇片和气雾剂样品中沙丁胺醇的回收率试验

图4 硫酸沙丁胺醇片加标色谱图（加标20 μg/mL）

图5 沙丁胺醇气雾剂加标色谱图（加标20 μg/mL）

在最佳色谱条件下操作，依据峰面积与浓度成正比用单点校正法计算硫酸沙丁胺醇片和气雾剂样品中沙丁胺醇的含量，结果见表4。图6和图7分别为硫酸沙丁胺醇片和气雾剂样品色谱图。

表4 硫酸沙丁胺醇片和气雾剂中沙丁胺醇含量测定结果

3 结语

沙丁胺醇作为短效的肾上腺素β2受体激动药，是较理想的控制哮喘急性发作的药物，同时它在皮肤、妇科等方面的应用也越来越引起人们的注意。随着制剂技术的发展，缓释、喷雾技术相继用于沙丁胺醇的制剂，使它克服了由于吸收快速而引起的震颤、恶心、心率增快或心搏异常强烈等不良反应，因而临床应用越来越广泛。目前，沙丁胺醇的检测方法以酶联免疫吸附法（FLISA）为主流，但高效液相色谱法（HPLC）由于具有灵敏度高、选择性好、分析时间短、样品用量少和易于实现自动化等优点，适合于沙丁胺醇制剂的含量测定和质量控制，现阶段仍作为沙丁胺醇最可靠的检测方法。

图6 硫酸沙丁胺醇片样品色谱图

图7 沙丁胺醇气雾剂样品色谱图

［1］徐德琴,汪骏,徐学君,臧志和.武警医学院学报,2008,19(2): 179-180.

Determination of salbutamol in salbutamol sulfate tablets and要salbutamol aerosol by RP-HPLC

Liu Jin-fang1,Ma Yan2,Liu Wei3
(1.Tianjin Zhuo Yuan Da Trading Co.,Ltd,Tianjin 300457,China; 2.Chongqing Academy of Metrology and Quality Inspection,Chongqing 401121,China; 3.Tianjin North China Geological Exploration Bureau,Tianjin 300181,China)

The method employed a shim-pack VP-ODS column(150mm×4.6mm，4.6μm)and a mobile phase of 85 volumes of potassium dihydrogen phosphate and 15 volumes of acetonitrile at a flow rate of 1.0mL/min.The detection wavelength was set at 225nm;The temperature of column was 40℃.A reversed-phase high performance liquid chromatographic method for salbutamol of salbutamol sulfate tablets and salbutamol aerosol was established. The results show that the liner range of salbutamol was 0.5～20μg/mL,r=0.9988,and RSD was less than 3.21%(n= 6).The average recover was 99.73%and 91.62%.This method was found to be simple,quick and accurate for simultaneous determination of salbutamol in salbutamol sulfate tablets and salbutamol aerosol.It can be used as the content determination and quality control of pharmaceutical preparations of salbutamol.

reversed-phase high performance liquid chromatographic method(RP-HPLC);salbutamol; salbutamol sulfate tablets;salbutamol aerosol

10.3969/j.issn.1008-1267.2016.06.014

O657.7+2

A

1008-1267（2016）06-0033-04

2016-7-10