白杨素衍生物对谷氨酸诱导的HT22 细胞损伤保护作用的研究

熊浙徽，张惠惠，张自清，马骋晨，齐 宇，李红侠

（宿州学院，安徽宿州 234000）

白杨素又名1，2-苯并吡喃酮，属于黄酮类化合物，可从紫葳科植物木蝴蝶中提取，尤其蜂胶中含量较高［1-2］，它具有多种生物活性和药理作用［3-7］.谷氨酸是中枢神经系统信号传递的主要递质之一，对维持中枢神经系统的稳定具有重要的作用［8］.当谷氨酸浓度过高时，会引发氧化应激反应，产生大量氧化中间产物，导致线粒体功能受损，进而产生更多的氧自由基，加重细胞的损伤、衰老和死亡.近年来研究发现脑缺血［9-10］、肌萎缩侧索硬化症、帕金森氏症、阿尔茨海默病［11-13］等神经性疾病均是由谷氨酸释放量过高引起的.临床研究表明，由神经损伤引起的疾病发病率、复发率、致残率、致死率都较高，但有效治疗药物少，治愈率低［14］.

HT22细胞系是小鼠海马神经元细胞系，来自HT4.正常状态下贴壁生长，普通DMEM 培养基加上血清，双抗即可培养.该细胞系是体外研究谷氨酸毒性的良好模型，在很多神经退化性疾病，例如阿尔茨海默病和帕金森中均有很好的应用.本实验以谷氨酸诱导HT22 细胞建立模型，通过加入白杨素衍生物，研究白杨素衍生物对神经细胞的保护作用，以期为相关疾病的治疗提供借鉴依据.

1 实验仪器、材料及试剂

1.1 实验仪器

本实验所用仪器主要有扫描酶标仪（Sunrise，奥地利TECAN），流式细胞仪（C6，BD 公司），CO2培养箱（Heracel，美国Kendro），倒置荧光显微镜（OLYMPUS CX -40，日本OLYMPUS），激光共聚焦显微镜（FV1200+IX83，日本Olympus），96孔细胞培养板和共聚焦专用小皿，96孔细胞培养板和6孔细胞等.

1.2 实验材料与试剂

实验材料为HT22细胞株，由中国科学院上海细胞生物学研究所提供.

实验所用试剂有DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（北京索莱宝生物科技有限公司），双抗、MTT（碧云天生物技术有限公司），线粒体膜电位检测试剂盒和活性氧检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），白杨素衍生物由宿州学院化学实验室提供，以下以CD表示.

2 实验方法

2.1 细胞存活率测定

将处于对数生长期的HT22细胞分为对照组（完全培养基培养24 h）、模型组也称谷氨酸处理组（细胞正常培养12 h 后，与谷氨酸作用24 h）和药物组（细胞正常培养12 h 后加10 mmol/L 谷氨酸1h，然加终浓度为2.5、5、10 μmol/L 的白杨素衍生物继续培养24 h）.白杨素衍生物终浓度为2.5、5、10、25 μmol/L，谷氨酸浓度10 mmol/L.

将对数生长期的HT22细胞，按每孔2×105细胞培养于96 孔板中，每孔加入100 μL，每组3个重复，待细胞贴壁后，对照组加入100 μL的完全培养基，模型组加入100 μL含谷氨酸浓度10 mmol/L的完全培养基，药物组加谷氨酸浓度10 mmol/L，1 h后，加药物CD的终浓度分别为2.5、5、10 μmol/L，继续培养（培养箱温度37℃，CO2浓度5%），24 h 后加MTT（浓度5 mg/mL，每孔15 μL），继续孵育4 h 后，弃去每孔的液体，加150 μL 的二甲亚砜，于水平摇床震荡8 -10 min，用酶标仪检测490 nm 处的吸光度值（A）和细胞存活率，细胞存活率计算公式如下：细胞存活率（%）=（实验组OD值-空白对照组OD值/对照组OD值-空白对照组OD值）x 100.

2.2 细胞线粒体膜电位检测

将HT22 细胞接种于共聚焦专用细胞培养皿中，按实验分组，对照组、谷氨酸组、药物组24 h后，弃去培养液，采用JC-1 试剂盒检测HT22 细胞线粒体膜电位，加入10 μg/mL JC-1 染液，于37 ℃下孵育20-25 min，用置于冰浴下的JC-1 染色缓冲液（1X）洗3 遍，加入1.5 mLDMEM 培养液，于激光共聚焦显微镜下在激发光为488和Cy3下，采集荧光信号.当线粒体膜电位低时，JC-1产生绿色荧光；当线粒体膜电位高时，JC-1 产生红色荧光，通过Image J 软件进行平均荧光强度的半定量分析，以红/绿相对荧光强度比来反映线粒体膜电位的变化.

2.3 细胞活性氧检测

将HT22 细胞接种于共聚焦专用细胞培养皿中，按实验分组，对照组、谷氨酸组、药物组24 h后，弃去培养液，采用ROS Assay Kit 试剂盒检测HT22 细胞线粒体内ROS 水平.加入终浓度为10 μmol/L 的DCFH-DA，于37 ℃细胞培养箱孵育25 min 左右，用不含血清的细胞培养液洗3 遍后，加入1.5 mLDMEM 培养液，于激光共聚焦显微镜在FITC 的参数设置下，采集荧光信号，通过Image J 软件进行平均荧光强度的半定量分析.

2.4 AV/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡

用Annexin V/PI 流式细胞仪来检测神经细胞HT22的凋亡，将对数生长期的HT22细胞接种6孔板（2×108个/mL细胞），根据实验分组，分组方法同活性氧，对照组加相同量的细胞培养基.培养结束后（24 h），将细胞收集，PBS（冷的）漂洗2次，悬浮于300 μL Binding Buffer，加入5 μL Annexin V-FITC/PI染色5 min后，再加入5 μL PI，轻振混匀，再加200 μL Binding Buffer，室温避光反应15 min，上机检测.用Flowjo7.6.1（FACSCA2BUR，Becton Dickinson，USA）软件进行数据分析及出图.

3 结果与分析

3.1 药物CD的性状

药物CD为浅黄色固体粉末，熔点187℃～190℃，分子量525.38，分子式C27H22Cl2N2O5.

3.2 药物对谷氨酸诱导的神经细胞存活率的影响

由图1a 可知，药物CD 对HT22 细胞存活率的影响，随着药物浓度的增加而降低，因此，适宜的药物浓度用量在2.5～10 μmol/L.图1b显示，10 mmol/L的谷氨酸处理24 h，谷氨酸模型组与对照组细胞相比较存活率下降一半，其存活率为50.111±0.34%，具有统计学极显著性差异.药物处理组与模型组比较，药物处理浓度为2.5、5、10 μmol/L 时，存活率为61.819±0.23%、71.688±0.56%、83.223±0.72%，细胞存活率显著升高.当药物浓度为10 μmol/L 时，细胞存活率达到最高，比模型组高出1.66 倍，且具有统计学极显著性差异.药物处理组提高了细胞的存活率，可以降低谷氨酸对HT22细胞的损伤.

图1 药物（CD）对细胞存活率的影响（，n=3）

3.3 药物对HT22细胞线粒体膜电位的影响

由图2可知，与对照组比，谷氨酸组和药物组（CD 分别为2.5，10μmol/L，加10 mmol/L谷氨酸）细胞红/绿相对荧光强度比均显著降低（P＜0.01），HT22 细胞线粒体膜电位均显著下降，但药物组处理后，细胞线粒体膜电位较模型组升高.随着药物浓度的增加，细胞线粒体膜电位显著增加（P＜0.01）.说明药物对谷氨酸损伤有一定的保护作用.

图2 药物（CD）对HT22细胞线粒体膜电位的影响

3.4 药物对HT22细胞活性氧的影响

由图3 可见，与对照组比，谷氨酸组和药物组（CD 分别为2.5，10μmol/L，加10 mmol/L 谷氨酸），HT22细胞内相对荧光强度均显著增加（P＜0.05），谷氨酸组达到极显著增加（P＜0.01），但药物处理组与模型组相比，细胞内相对荧光强度均降低，且随药物浓度增加而降低，说明对细胞的损伤程度也随之降低.

图3 药物（CD）对HT22细胞线粒体内ROS水平的影响

3.5 药物对细胞凋亡的影响

使用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术，24 h后检测各组HT22细胞的凋亡变化，图4是流式细胞仪的散点图，图中C表示活细胞，即FITC-/PI-；D表示早期细胞凋亡，即FITC+/PI-；B表示晚期凋亡，即FITC+/PI+；A表示死亡细胞，即FITC-/PI+.模型谷氨酸组，细胞凋亡率为34.81%，是对照组的18.82倍，药物处理组，当药物浓度为2.5 μmol/L+10 mmol/L谷氨酸，细胞凋亡率为23.57%，较模型组下降11.24%，药物浓度为10 μmol/L+10 mmol/L谷氨酸，细胞凋亡率为12.25%，较模型组下降22.56%，由此看出，药物对谷氨酸损伤的保护作用随药物浓度（2.5-10 μmol/L）的增加而增强.

图4 谷氨酸诱导的HT22细胞经不同浓度药物处理后的细胞凋亡

4 结论

关于谷氨酸诱导细胞损伤导致的疾病，其治疗药物稀缺，去寻找和研究有效的药物对于治疗由谷氨酸诱导的细胞损伤具有重要的意义.实验结果显示，10mmol/L 的谷氨酸处理的HT22 细胞24 h 后，细胞存活率明显降低，线粒体膜电位显著降低，活性氧显著增强，细胞的凋亡率显著升高；当给与白杨素衍生物的药物CD培养HT22细胞24 h，与模型组比较，细胞存活率显著增加，在药物CD 浓度为2.5-10 μmol/L 时，处理效果较好.线粒体膜电位较模型组显著升高，活性氧较模型组下降，细胞凋亡较模型组降低.研究结果表明，白杨素衍生物能够保护谷氨酸诱导的HT22细胞损伤.