葛根素对血管性痴呆小鼠皮层神经元延迟整流钾电流的作用

田华++刘富++刘冰华++高音++曲丽辉

摘 要：目的：旨在观察葛根素对血管性痴呆小鼠的神经保护作用及其机制的探讨。方法：通过采用改良的双侧颈总动脉持久性结扎法制作血管性痴呆模型，并利用全细胞式膜片钳技术及分子生物学技术，观察葛根素对血管性痴呆小鼠皮层神经元延迟整流钾电流的影响。结果：（1）与正常组相比，血管性痴呆小鼠皮层神经元Ik电流强度下降，下降幅度为14.79%±5.6%（P<0.05）。（2）与模型组相比，葛根素组的Ik电流幅度呈现显著下降抑制率为（34.48±8.3）%（n=5，P﹤0.01）。（3）Western blot结果显示，模型组KV 2.1表达低于正常组（P<0.05）；与正常组和模型组相比，葛根素组KV 2.1的表达量均明显降低（P<0.05）。结论：葛根素可能通过抑制延迟整流钾电流对血管性痴呆小鼠皮层神经元发挥一定的神经保护作用。

关键词：葛根素 顶叶皮层 全细胞式膜片钳技术 延迟整流钾电流

中图分类号：G64 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）04（b）-0250-02

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是继阿尔茨海默病之后第二位最常见的痴呆症，在我国老年人中尤为常见和多发。血管性痴呆实际上是指大脑功能衰退，特别是与智能有关的功能全面衰退。造成脑血管性痴呆的主要原因是脑血流量减少， 引起脑组织生化代谢障碍[1-2]。

葛根素（Puerarin，Pur）从葛根中提取出的有效成分，化学名为4，7—一二羟基-8-D葡萄糖基异黄酮，近年对葛根的研究较为深入，目前葛根素被广泛用于心脑血管疾病等急性期的治疗，包括心绞痛、心肌梗塞，心律失常、脑缺血等[3]。临床研究发现，葛根素能明显降低脑梗死患者的梗死灶面积，降低急性脑梗死患者的血流变和提高神经功能学评分[4]。各种离子通道的结构和功能异常与心脑血管疾病的发生和发展密切相关，文献报道，葛根素可不同程度的影响心肌钠、钾、钙离子通道[5-6]。然而对于葛根素的神经保护作用机制的研究方法主要集中在利用酶学、形态学及免疫组化等方面，利用膜片钳技术考察葛根素其神经保护作用的研究较少，唐瑜等利用膜片钳技术发现，葛根素可以抑制脑缺血再灌注损伤的大鼠海马CA1区锥体细胞L-型钙通道[7]，但是葛根素对小鼠皮层神经元钾离子通道的作用如何目前仍未见报道。故本实验拟采用全细胞式膜片钳技术观察葛根素对血管性痴呆小鼠顶叶皮层神经元延迟整流钾电流（IK）的调制作用，从离子通道角度为进一步揭示葛根素防治缺血性脑损伤的可能机制奠定一定的理论基础。

1 材料和方法

（1）建立动物模型及分组成年昆明小鼠，18～22 g，雌雄不限，由齐齐哈尔医学院动物研究中心提供。采用双侧颈总动脉持久性结扎法，并对该方法进行改良制作血管性痴呆模型，采用跳台试验鉴别血管性痴呆动物模型是否成功建立。模型建立后小鼠随机分为正常组、模型组和葛根素组，各组立即给予相应药物。正常组和模型组：腹腔注射生理盐水，1次/日，注射14天。葛根素组：腹腔注射葛根素注射液（1 mg/mL），1.0 mL/100 g，1次/日，注射14 d。

（2）试剂与仪器 Protease、EGTA 、HEPES均为Sigma公司产品，葛根素注射液（安徽联谊药业股份有限公司）；β-actin、Kv2.1抗体及其相应二抗购自santa cluz公司，其余均为国产分析纯试剂。IBBMClamp32数据采集分析系统以及PC-IIC型膜片钳放大器均由华中理工大学研制。

（3）神经元急性分离与全细胞记录。将小鼠急性断头取脑，取顶叶皮质，并置于人工脑脊液（ASF）（0～4 ℃）中，将其切成冠状脑片（厚度约400～500 μm），在预先通好（95% O2+5% CO2）混合气的ASF（37℃）中孵育30min，之后在含0.5%protease的ASF（37℃）中消化30-35 min，连续通混合气并微震荡脑片。消化结束后，取2片脑片用0～4℃ASF冲洗3次，用剪刀将组织剪碎成1mm3的组织块，用尖端抛光的Pasteur吸管吹打并吹散组织块，静置3～5 min后，吸取上清液滴于预先备好的细胞外液培养皿中，静置待细胞贴壁，选取状态良好的神经元进行全细胞式膜片钳实验，首先使电极贴近细胞并形成高阻封接（>1 G?），负压吸引形成全细胞式，在电压钳模式下，将保持电压（HP）置于-80 MV，首先给予﹣40MV的预刺激，波宽150 ms，随后给予去极化脉冲刺激（﹣40 MV—+60 MV），阶跃电压10MV，刺激波宽150 ms，以300 ms处的电流值计算IK并观察其变化。

（4）统计学分析。实验结果中IK以300 ms处的电流值统计计算，抑制率计算公式为：（1-IK实验组/IK对照组）×100%。结果分析采用SPSS软件，结果用（x±SD）表示，t检验进行统计学分析。

2 结果

2.1 葛根素注射液对血管性痴呆小鼠皮层神经元Ik的抑制作用

急性分离各组小鼠皮层神经元，取状态良好的神经元进行实验。形成全细胞封接后，以300 ms处的电流值计算IK。记录的外向电流可被四氨基吡啶（4-AP）（2 μmol/L）和四乙胺（TEA）（10 μmol/L）所抑制，用CSCl替换电极内液KCl则不能激活出此外向电流，证实该电流为延迟整流钾电流并记录。以在指令电压+60 mV时电流值进行统计处理，与正常组相比，血管性痴呆小鼠皮层神经元Ik电流幅度有所下降，下降幅度为（14.79±5.6）%（P<0.05）；与模型组相比，葛根素组的Ik电流幅度呈现显著下降，抑制率为（34.48±8.3）%（n=5，P﹤0.01）。

2.2 葛根素对血管性痴呆小鼠皮层Kv2.1蛋白表达量的影响

急性分离的各组小鼠顶叶皮层脑组织，用细胞裂解液处理，细胞蛋白溶出，进行蛋白定量，采用Western blot方法，用抗体检测细胞KV 2.1含量，实验结果显示，正常组、模型组、葛根素组均可见有KV 2.1表达条带；定量分析显示，模型组KV 2.1表达低于正常组（P<0.05）；与正常组和模型组比较，而葛根素组KV 2.1的表达量均明显降低（P<0.01，P<0.05）。endprint

3 讨论

脑血管性痴呆与离子通道结构和功能异常之间有着密切的关系，钾通道是分布最广、类型最多的一类离子通道，具有种类多、亚型多、性质复杂等的特点，几乎存在于所有的细胞膜上并发挥着多种生物功能。本实验中，在电压为-40 mV时瞬时外向钾电流已经失活，激活的外向电流可以被4-AP和TEA所抑制，此外，若电极内液KCl被CsCl替代后则不能激活出此外向电流，因此可证实此外向电流是电压门控性延迟整流钾电流。

以往研究主要通过考察葛根素对大、小鼠各脑区神经递质、酶类或者神经细胞形态学的影响试图揭示葛根素对神经系统保护作用及机制，如葛根素对缺氧缺糖、谷氨酸钠引起的体外培养大鼠星形胶质细胞损伤的保护作用[8]，能减少突触体钙超载和神经元阳性凋亡细胞出现率， 提示葛根素的抗神经细胞凋亡作用与抑制突触体钙超载有关[9]。但从离子通道角度探讨葛根素的神经保护机制，尤其是葛根素对血管性痴呆动物模型离子通道的影响报道较少。

研究表明，脑缺血所致的脑组织损伤可使神经元细胞膜钾通道失活，细胞膜去极化，导致细胞兴奋性升高， 致使膜电位不易恢复。IK电流是由延迟整流钾通道介导的钾离子外流产生的，能延长动作电位时程，影响神经递质的释放，还可参与皮层神经元的调亡过程。本实验结果发现，血管性痴呆小鼠腹腔注射葛根素注射液14天后，绝大多数小鼠的顶叶皮层神经元的IK明显降低，同时分子生物学结果显示，葛根素可降低血管性痴呆小鼠顶叶皮层脑区Kv2.1蛋白的表达。以上结果与文献报道一致[10]。本实验结果揭示葛根素血管性痴呆小鼠顶叶皮层神经元IK有抑制作用，可能会影响神经递质的释放，参与机体免疫与炎症反应过程，调节机体在生理或病理条件下的免疫功能。研究发现，在神经元退行性变过程中，钾通道阻断剂TEA通过阻断IK电流发挥保护易感细胞亚群的作用。那么，本实验发现葛根素对血管性痴呆小鼠皮层延迟整流钾电流也存在一定的抑制作用，提示，葛根素可能在神经元退行性变过程中也可能发挥一定的保护易感细胞亚群的作用，但具体机制如何尚不明确，有待进一步研究。

参考文献

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[7] 唐瑜，刘馨莲，樊萌，罗荣敬，周乐全.葛根素抑制脑缺血再灌注损伤的大鼠海马CA1区锥体细胞L-型钙通道[J].基础医学与临床，2007，27（10）：1172-1174.

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[10] 陈悦，黄霞，卫琼玲.葛根素对豚鼠乳头肌动作电位及延迟整流钾电流的影响[J].中国药学杂志，2006，41（10）：747-749.endprint