钛酸锶微/纳米颗粒的体外炎症反应

刘文涛，吴宏，周吉祥

钛酸锶微/纳米颗粒的体外炎症反应

刘文涛1，吴宏1，周吉祥2

(1. 中南大学 粉末冶金国家重点实验室，长沙 410083；2. 中南大学 湘雅医院，长沙 410083)

采用细胞与材料直接作用的方式研究钛酸锶微/纳米颗粒刺激RAW 264.7细胞产生的生物学反应。利用扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)、激光粒度仪、X射线衍射仪及比表面积测定仪表征材料的理化性质。采用CCK-8检测和活/死细胞染色法评估钛酸锶微/纳米颗粒对RAW 264.7细胞增殖活性的影响；采用SEM观察细胞的形态变化；采用RT-qPCR技术检测在钛酸锶微/纳米颗粒刺激作用下RAW 264.7细胞炎性细胞因子基因的表达；采用免疫荧光染色技术检测RAW 264.7细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表达。结果表明，微米和纳米钛酸锶颗粒成分组成均一，皆为不规则形状，微米钛酸锶颗粒平均粒径为1 085.0 nm，比表面积为1.72 m2/g，纳米钛酸锶颗粒平均粒径为505.2 nm，比表面积为2.94 m2/g。微米和纳米钛酸锶颗粒对RAW 264.7细胞第24 h、72 h活性并无影响。在微/纳米钛酸锶颗粒的刺激下RAW 264.7细胞向多边形发展，并具有更大的贴附面积。微米钛酸锶颗粒刺激RAW 264.7细胞高表达iNOS、白细胞分化抗原(cluster of differentiation, CD)86、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α和白细胞介素(Interleukin，IL)-6基因。纳米钛酸锶颗粒刺激RAW 264.7细胞高表达iNOS和TNF-α基因，而IL-10基因的表达显著下调。微米和纳米均刺激RAW 264.7细胞高表达iNOS，诱导RAW 264.7细胞向M1表型极化，产生炎症反应，并且微米钛酸锶颗粒诱导的炎症反应更显著。

钛酸锶；微/纳米颗粒；RAW 264.7 细胞；细胞因子；炎症反应

随着人口老龄化进程的加速，关节炎、脊椎病和骨肿瘤等骨缺损疾病在全世界的发病率逐年上涨。人工关节置换术对骨关节炎和类风湿性关节炎等终末期关节炎具有有效的手术干预作用[1−2]。但是，研究表明，人工关节置换的失败率在植入后10～20年后会增 加[2−4]。其原因是骨溶解引起的人工关节松弛[5]。骨溶解与骨植入物材料在服役过程中产生的磨损碎屑在病变部位产生长期的慢性炎症反应，导致骨溶解的发 生[6−7]。BLOEBAUM等[8]通过对覆盖有羟基磷灰石涂层的骨植入物相关回收组织的分析表明，羟基磷灰石磨损碎片可有效刺激免疫细胞并释放多种细胞因子。这些细胞因子可能会导致肉芽肿性炎症，以及骨骼重塑紊乱引发骨溶解过程[8]。骨植入物在服役过程中表面的涂层磨损、剥落产生的颗粒可能会形成类似的过程，诱导局部区域产生不良的炎症反应[9−10]。这可能对骨−植入物界面的完整性产生不利影响。

骨溶解的机制主要涉及巨噬细胞，巨噬细胞是一种吞噬性白细胞。吞噬磨损碎片后，巨噬细胞释放促炎性细胞因子白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等，导致破骨细胞的激活[11−12]。被激活的破骨细胞继而引起骨溶解[2−13]。因此，巨噬细胞对吞噬物的吞噬作用在骨溶解中起着重要的作用。INGRAM等[14]报道了大小为0.1～10 μm的聚乙烯颗粒激活了巨噬细胞的炎症反应。相类似的，ABU-AMER等[15]报告了大小为0.2～10 μm的聚甲基丙烯酸甲酯颗粒会影响巨噬细胞炎性细胞因子的表达。而KOSEKI等[16]和SABOKBAR 等[17]研究发现，小于1 μm的颗粒也会引起这些免疫细胞的生物学反应。

在目前的研究中，已证实颗粒粒径对巨噬细胞的生物学反应具有重要的影响。然而，化学成分同样是影响巨噬细胞生物学反应的重要因素之一[15, 17]。Sr2+可以促进干细胞的成骨分化以及抑制炎症反应[18−20]。JIANG等[21]通过磁控溅射技术在喷丸酸蚀处理的纯钛表面构建了钛酸锶涂层，显著提高了MC3T3-E1细胞的增殖分化活性。而目前关于具有不同粒径、表面积等参数的钛酸锶颗粒对巨噬细胞生物学反应的报道较少。因此，有必要研究不同粒径的钛酸锶颗粒对巨噬细胞行为的影响机制，以助抑制不良的炎症反应。

在本工作中，通过研究巨噬细胞的活性、形态变化以及促炎性细胞因子基因的表达，研究了两种不同粒径和比表面积的钛酸锶颗粒对巨噬细胞生物学反应的影响。

1 实验

在细胞实验部分，为了确定培养基中添加的粉末质量，本工作参考了GONZÁLEZ等[22]的研究工作，他们证实了聚甲基丙烯酸甲酯颗粒的表面积会影响单核细胞的活性。SHANBHAG等[23]证明了单核细胞对培养基中材料暴露出来的表面积极其敏感，并且表面积比(SAR=细胞表面积/材料表面积)=10时，细胞未被激活，在SAR = 0.1时，细胞被高度激活，当SAR = 1时细胞分泌了最多的细胞因子。因此，本工作中选择SAR=1。其中，细胞被假定为球形，1×106个细胞的总表面积为1.52 ×103mm2。

1.1 材料

所使用的纳米钛酸锶(99.5% metalsbasis，<100 nm)和微米钛酸锶(99.5% metalsbasis，5 μm)均购自上海麦克林生化科技有限公司，将纳米钛酸锶命名为NS，微米钛酸锶命名为MS。

1.2 理化性能测试

采用配备有能量色散X射线光谱仪(Energy Dispersive X-ray Spectroscopy，EDS)的扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope，SEM；Quanta 250 FEG，FEI，捷克)观察样品形貌。通过激光粒度仪测量样品粒径分布，通过比表面仪(Quadrasorb SI-3MP，康塔公司，美国)根据BET法测定样品比表面积。通过X射线衍射仪(X-ray Diffraction，XRD；Advance D8，Bruker，德国)检测样品物相组成。

1.3 细胞培养

选择小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW 264.7细胞)作为巨噬细胞的模型。RAW 264.7细胞使用DMEM完全培养基培养，该培养基由89%HG-DMEM培养基(Gibco，美国)、10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS；Gibco，美国)和1%青霉素−链霉素(Penicillin-Streptomycin Solution，PS；Gibco，美国)组成，将培养的细胞置于37 ℃、5%CO2和95%湿度的培养箱中，每48 h更换一次培养基。

1.4 巨噬细胞活性

将RAW 264.7细胞按每孔内30 000个种植在48孔板中，每孔加入0.5 mL含有NS/MS的DMEM完全培养基对细胞进行培养，培养基中NS/MS的含量按照SAR=1的原则添加，每48 h更换一次培养基。使用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8；Dojindo，日本)来定量的测定巨噬细胞的增殖活性。培养24 h和72 h后，将0.27 mLDMEM完全培养基与0.03 mLCCK-8混合，并添加到每个孔中孵育30 min。随后，从每个孔中吸取0.1 mL孵育溶液转移到96孔板中。用多模式读板仪(thermo fisher scientific，美国)在450 nm下测量光密度(optical density，OD)值。采用活死染色法定性检测细胞活性。活死染色法步骤如下：吸弃孔板中的旧培养基，并用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution，PBS；Gibco，美国)洗涤两次，每次1～2 min。随后，在每孔中加入0.3 mL使用PBS溶液配制的钙黄绿素-AM(2 mg/L)(Dojindo，日本)和典化丙啶(3 mg/L)(Dojindo，日本)混合溶液，于闭光条件下37 ℃孵育15 min，吸弃废液然后使用PBS溶液洗去残留的染色液，使用倒置荧光显微镜拍照(DSY-L140，北京长恒荣创科技有限公司，中国)。

1.5 巨噬细胞形貌

将RAW 264.7细胞按每孔内300 000个种植在放有硅片的6孔板中，每孔加入2.5 mL含有NS/MS的DMEM完全培养基对细胞进行培养，培养基中NS/ MS的含量按照SAR=1的原则添加，每48 h更换一次培养基。培养48 h后，吸弃旧培养基，并用PBS洗涤两次，每次5 min。然后将0.3 mL的2.5%戊二醛溶液(Sigma，美国)添加到每个孔中，并置于4 ℃的冰箱中保持3 h。吸弃戊二醛溶液，然后用PBS洗涤两次，每次5 min。用PBS和乙醇(浓度梯度为30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)的混合溶液以及乙醇和叔丁醇(浓度梯度为25%、50%、75%、100%)的混合溶液使细胞脱水，每种溶液浸泡5 min。将脱水后的样品置于50 ℃真空干燥箱中干燥。使用SEM拍摄细胞的贴附形态。

1.6 巨噬细胞基因表达

将RAW 264.7细胞按每孔内300 000个种植在6孔板中，每孔加入2.5 mL含有NS/MS的DMEM完全培养基对细胞进行培养，培养基中NS/MS的含量按照SAR=1的原则添加，每48 h更换一次培养基。培养48 h后，通过向每个孔中加入1 mL MZ缓冲液(天根，中国)裂解细胞。随后，按照试剂说明书的规程，使用miRNA分离试剂盒(天根，中国)提取总RNA，并通过NanoDrop分光光度计(NanoDrop2000，Thermo Fisher Scientific，美国)对RNA的含量进行定量检测。使用QuantScript RT试剂盒(天根，中国)将提取的RNA逆转录为cDNA。使用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR；CFX96 Touch，Bio-Rad，美国)测量被SYBR Green Supermix (Bio-Rad，美国)标记的相关基因的表达水平。实验中所使用的各引物基因序列如表1所列。

1.7 免疫荧光染色

选择诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)作为巨噬细胞M1表型的表面标记物，使用免疫荧光染色技术对iNOS进行标记以进一步确定RAW 264.7细胞的表型。将细胞用4%多聚甲醛固定30 min，用1%Triton X-100溶液处理5 min，然后用10%山羊血清封闭2 h。随后使用iNOS一抗(1：500 PBS，Abcam，美国)将细胞在37 ℃孵育12 h，然后使用包含Alexa Fluor 594(1:200 PBS，Abcam，美国)的二抗溶液孵育30min。细胞核用2 μg/mL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(C16H17Cl2N5，DPAI；Sigma，美国)溶液染色30 s。使用倒置荧光显微镜记录荧光图像。

表1 引物的基因序列

1.8 数据统计与分析

从至少3次平行实验中得出结果，并表示为平均值±标准差。使用最小显著差异(least significant difference，LSD)方法对数据进行统计分析。*p、#p< 0.05和**p、##p< 0.01被认为具有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 钛酸锶微/纳米颗粒的理化性质

如图1所示，NS和MS均为无规则颗粒状，其中NS的颗粒平均尺寸约为0.436 3 μm，MS的颗粒平均尺寸约为1.745 5 μm。通过EDS分析，在NS和MS上均探测到Ti、Sr、O、C四种元素，两组中Ti跟Sr的比例均接近1:1，表明试样较纯。而C元素的存在可能是由于样品较小导致导电胶中的C被检测到，这可能也是NS上检测到更多C含量的原因。

图2所示为通过激光粒度分析NS和MS的粒径分布。由图可知，可见NS的粒径在300～800 nm之间，而MS的粒径在600～2 100 nm之间，这与SEM所观察的结果一致。

通过BET法测定了NS和MS的比表面积，NS的比表面积为2.94 m2/g，MS的比表面积为1.72 m2/g。NS和MS的形状、粒径分布、平均粒径和比表面积信息如表2所列。

图3所示为NS和MS的XRD图谱。由图可知，NS和MS的XRD图谱与钛酸锶的标准PDF卡片PDF#84-443相一致，表明NS及MS的物相组成为钛酸锶，这与EDS结果一致。

2.2 钛酸锶微/纳米颗粒对RAW 264.7细胞的影响

图4所示为通过活/死细胞染色及CCK-8测试评估的NS及MS对RAW 264.7细胞的细胞活性的影响。结果表明，将RAW 264.7细胞暴露在具有NS及MS的环境中培养24 h和72 h后，与空白组相比，各组均未表现出细胞毒性，展现出良好的细胞相容性。

图5所示为RAW 264.7细胞与NS或MS共培养4 h后的形态。由图可知，将RAW 264.7细胞与NS/MS共培养48 h后，RAW 264.7细胞有向多边形发展的趋势，且相对空白组，NS和MS组RAW 264.7细胞具有更大的铺展面积。

图1 (a) NS和(b) MS的形貌及元素组成

图2 (a) NS和(b) MS粉末的粒径分布

表2 NS和MS粉末的形貌、粒径分布、平均粒径和比表面积

图3 NS和MS粉末的XRD图谱

图4 暴露在含有NS或MS环境中的RAW 264.7细胞的细胞活性

(a) Live (green)/dead (red) cell staining; (b) CCK8 test

图6所示为RAW264.7细胞与NS或MS共培养48 h后炎症基因的表达水平。由图可知，NS和MS组RAW 264.7细胞高表达巨噬细胞M1表型表面标记物基因iNOS，而白细胞分化抗原(cluster of differentiation，CD)86基因的表达仅在MS组显著提升，各组之间巨噬细胞M2表型表面标记物基因甘露糖受体(CD206)的表达在统计学上没有显著性差异，表明纳米和微米钛酸锶颗粒都将诱导巨噬细胞向M1表型极化，且微米钛酸锶的诱导作用更显著。促炎性细胞因子基因TNF-α在NS和MS组均上调，而IL-6仅在MS组上调且显著高于NS组，抗炎性细胞因子IL-10在NS组下调，表明纳米和微米钛酸锶颗粒将激活RAW 264.7细胞产生炎症反应，相对纳米钛酸锶颗粒，微米钛酸锶颗粒具有更强烈的刺激作用。

图5 RAW 264.7细胞与NS或MS共培养48 h后的形态

图6 RAW 264.7细胞与NS或MS共培养48 h后炎症基因的表达水平(与NS相比*p <0.05和**p <0.01，与NS相比##p<0.01)

(a) iNOS; (b) CD86; (c) CD206; (d) TNF-α; (e) IL-6; (f) IL-10

为了进一步评估RAW 264.7细胞在各环境中的极化状态，采用了免疫荧光染色来评估RAW 264.7细胞M1表型表面标记物iNOS的表达水平，结果如图7所示。蓝紫色荧光表示细胞核，红色荧光表示iNOS，红色荧光的强弱代表了iNOS的表达量。iNOS在各组的表达水平如下：MS>NS>空白组，表明与空白组相比，微米、纳米钛酸锶颗粒均倾向于诱导RAW 264.7细胞向M1表型极化，其中微米钛酸锶颗粒的诱导作用更显著。

此前的研究已经表明，0.1～10 μm颗粒会影响巨噬细胞的活性和炎症反应[14−17]。然而，成分、颗粒数量、形状和表面积也会对巨噬细胞的行为产生影响，并且各种因素之间会相互影响。截止目前，尚未有定论确定什么是决定巨噬细胞命运的最主要因素。在本工作中，采用SAR=1来使材料暴露于细胞的面积一致，研究了RAW 264.7细胞暴露于纳米和微米钛酸锶颗粒的活性、形态变化以及炎症反应。并且，由于采用的两种钛酸锶都是无规则颗粒状(图1)，因此可以排除掉由于颗粒形貌差异造成的影响。

图7 Nuclei(蓝紫色)和iNOS(红色)的免疫荧光染色

YOSHIOKA等[24]研究发现大于5.6 μm的聚甲基丙烯酸甲酯颗粒会显著抑制巨噬细胞的活性。在本研究中发现纳米和微米钛酸锶颗粒都不会影响RAW 264.7细胞的活性，这可能是由于采用的钛酸锶颗粒尺寸(<2.1 μm)远小于5.6 μm。此外，也可能与钛酸锶良好的细胞相容性有关[21]。RAW 264.7细胞在纳米和微米钛酸锶颗粒的刺激下有向更大面积的多边形形态发展的趋势(图5)，尽管目前现有的研究对于巨噬细胞形态与表型之间的关系尚存在争议，但是M1表型表面标记物基因iNOS和CD86的高表达证明了纳米和微米钛酸锶颗粒诱导RAW 264.7细胞激活为M1表型。多项研究表明，颗粒尺寸的增大激活巨噬细胞产生更显著的炎症反应[15−16, 24]，这与本工作中的结果一致，微米钛酸锶颗粒诱导RAW 264.7细胞上调促炎性细胞因子基因TNF-α和IL-6的表达。尽管许多研究结果 表明，Sr2+具有诱导巨噬细胞向M2表型极化，并下调TNF-α、IL6等促炎性细胞因子表达的作用，但是可能颗粒本身对巨噬细胞的刺激作用更显著[25−26]。基于以上的结果，可以认为，在设计骨植入材料时，应尽量避免产生大尺寸的磨损颗粒。

3 结论

1) 微/纳米钛酸锶颗粒(<2.1 μm)对RAW 264.7细胞第24 h、72 h的增殖活性没有显著性影响，具有良好的细胞相容性。

2) 微/纳米钛酸锶颗粒刺激RAW 264.7细胞形态向多边形发展，并且贴附面积变大。

3) 微米钛酸锶颗粒刺激RAW 264.7细胞高表达iNOS、CD86、TNF-α和IL-6基因，并且iNOS、TNF-α和IL-6基因的表达显著高于纳米钛酸锶颗粒。纳米钛酸锶颗粒刺激RAW 264.7细胞高表达iNOS和TNF-α基因，而IL-10基因的表达显著下调。

4) 微米和纳米钛酸锶颗粒诱导RAW 264.7细胞向M1表型极化，产生炎症反应，并且微米钛酸锶颗粒诱导的炎症反应更显著。

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Inflammatory response of strontium titanate micro/nanoparticles in vitro

LIU Wentao1, WU Hong1, ZHOU Jixiang2

(1. State Key Laboratory of Powder Metallurgy, Central South University, Changsha 410083, China;2. Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410083, China)

The biological response of RAW 264.7 cells stimulated by strontium titanate micro/nanoparticles was studied by the direct interaction between cells and materials. Scanning electron microscope (SEM), laser particle size analyzer, X-ray diffractometer and specific surface area tester were used to characterize the physical and chemical properties of the materials. The effects of strontium titanate micro/nanoparticles on the proliferation activity of RAW 264.7 cells were evaluated by CCK-8 test and live/dead cell staining; the morphological changes of cells were observed by SEM; The expression of inflammatory cytokine genes in RAW 264.7 cells stimulated by strontium acid micro/nanoparticles. The results show that the compositions of the micron and nano strontium titanate particles are uniform and both have irregular shapes. The average particle size of the micron strontium titanate particles is 1 085.0 nm, the specific surface area is 1.72 m2/g, and the particle size of the nano strontium titanate particles is 505.2 nm. The specific surface area is 2.94 m2/g. The micron and nano strontium titanate particles have no effect on the proliferation activity of RAW 264.7 cells on the 24h and 72h. Under the stimulation of micro/nano strontium titanate particles, the RAW 264.7 cell morphology develops into a polygonal shape and has a larger attachment area. Micron strontium titanate particles stimulated high expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), cluster of differentiation (CD) 86, TNF-α and interleukin (IL)-6 genes in RAW 264.7 cells, and the expression of iNOS, tumor necrosis factor (TNF)-α and IL-6 genes is significantly higher than that of nano strontium titanate particles. nano strontium titanate particles stimulated RAW 264.7 cells to highly express iNOS and TNF-α genes, while IL-10 gene expression is significantly down-regulated. Both micron and nano strontium titanate particles stimulate RAW 264.7 cells to highly express iNOS, induce RAW 264.7 cells to polarize to the M1 phenotype, and produce an inflammatory response. The inflammatory response induced by micron strontium titanate particles is more significant.

strontium titanate; micro/nanoparticles; RAW 264.7 cells; cytokine; inflammatory response

TB32

A

1673-0224(2021)05-475-08

国家自然科学基金资助项目(52071346)；长沙市自然科学基金资助项目(kq2014293)

2021−04−26；

2021−06−02

吴宏，教授，博士。电话：0731-88836296；E-mail: wuhong927@126.com

(编辑 高海燕)