纤维素纳米晶荧光探针的制备及其对Fe3+荧光传感检测

褚友露 宋如愿 戴红旗 吴伟兵，*

（1. 齐鲁工业大学（山东省科学院）生物基材料与绿色造纸国家重点实验室，山东济南，250353；2. 南京林业大学江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏南京，210037）

基于染料分子 （如蒽醌［1-2］、香豆素［3-4］、罗丹明［5-6］等）的传统荧光探针受有机染料自身限制，存在亲水性差、量子产率低、光稳定性差等问题［7］。而基于纳米材料的荧光探针［8］，由于纳米材料的独特性质，具有选择性好和灵敏度高的优点［9］，还可有效克服有机染料分子的缺陷。随着环境友好、可持续发展的战略要求，以天然高分子物质如纤维素、壳聚糖、海藻酸钠、蛋白质等为载体的荧光探针已成为高分子科学的前沿领域之一［10-11］。纤维素纳米晶（cellulose nanocrystal，CNC）［12］具有许多优良特性，如高结晶度、高亲水性、超精细结构、生物相容性和可生物降解性等［13-14］；此外，CNC的比表面积和长径比大，表面存在大量活性基团，是良好的功能化载体，适合进行多功能设计和复合。相较于金属纳米粒子［15］、无机纳米粒子［16-17］、高分子自组装纳米粒子［18-19］等载体，CNC 具有更好的可修饰性以及独特的纳米形态［20-21］。以CNC 为载体，构造多功能CNC 荧光探针是一个创新、有意义的研究方向。本实验主要通过1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）体系将N-（4-氨基苯基）-4-（N，N-二甲基乙二胺基）-1，8-萘酰亚胺（EADANI）染料接枝到TEM⁃PO 氧化的CNC 载体上，从而制得具有高荧光发射强度的CNC 荧光探针（FCNC），并将其应用于Fe3+的荧光传感检测。

1 实 验

1.1 实验试剂和仪器

4-溴-1，8 萘二甲酸酐（＞95%）、1，4-苯二胺（＞98%），购自于东京化成工业株式会社；甲醇、乙醇、盐酸（HCl）、乙酸、氯化钠（NaCl）、氢氧化钠（NaOH）、硝酸银（AgNO3）、硝酸铅（Pb（NO3）2）、三氯甲烷、三水合硝酸铜（Cu（NO3）2·3H2O）、氯化锌（ZnCl2）、六水合硝酸镁 （Mg（NO3）2·6H2O）、六水合三氯化铁（FeCl3·6H2O）、四水合氯化亚铁（FeCl2·4H2O）、重铬酸钾（K2Cr2O4）均购自于南京化学试剂股份有限公司，分析纯，未进一步纯化直接使用；三乙胺（≥99.0%）、溴化钾（KBr，≥99.0%）、2-甲氧基乙醇（≥99.0%）、二甲基甲酰胺（DMF），购自于国药集团化学试剂有限公司；N，N-二甲基乙二胺（98%），购自于上海麦克林生化科技有限公司；四甲基哌啶氮氧化物（TEMPO，98%），购自于美国西格玛奥德里奇公司；溴化钠（NaBr，≥99.0%）、次氯酸钠（NaClO，5.0%～10.0%）、碘化钾（KI，≥99.0%）、硫代硫酸钠（Na2S2O3，≥99.0%），购自于上海久亿化学试剂有限公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。

1.2 EADANI染料的合成

EADANI染料的合成参考文献［22-23］进行。在装有回流冷凝装置的250 mL 的圆底烧瓶中，将2.19 g（7.20 mmol）4-溴-1，8-萘二甲酸酐和0.82 g（7.40 mmol）1，4-对苯二胺溶于140 mL乙醇和10 mL水的混合溶剂中。N2保护下，78℃回流4 h。放置过夜，过滤析出沉淀，以乙醇淋洗，干燥，得到固体N-（4-氨基苯基）-4-溴-1，8-萘酰亚胺。

将3.67 g（0.01 mol）N-（4-氨基苯基）-4-溴-1，8-萘酰亚胺、8.90 g（0.10 mol）N，N-二甲基乙二胺、1.20 g（0.012 mol）三乙胺、50 mL 2-甲氧基乙醇加入至三口烧瓶中，用加热套加热至120℃，回流4 h后冷却至室温，静置一段时间后真空抽滤，乙醇淋洗，最后用柱层析法进行分离提纯（洗脱剂：V（CH3OH）∶V（CHCl3）=1∶10），旋转蒸发后得到固体EADANI（1.50 g）并进行避光保存。然后对EADANI 染料分别进行核磁共振（NMR）和傅里叶变换红外光谱（FTIR） 表征。1H NMR（600 MHz，MeOD）δ：2.71（s，3H）、2.72（s，3H）、2.77（t，2H）、3.55（t，2H）、6.84（d，1H）、6.85（d，1H）、6.86（d，1H）、6.99（d，1H）、7.01（d，1H）、7.70（t，1H）、8.40（d，1H）、8.53（d，1H）、8.54（d，1H）。FT-IR：3444 cm-1、3474 cm-1（双峰，—NH2）；3369 cm-1（单峰，—NH）。

1.3 CNC的制备

将10 g（绝干）漂白针叶木浆、0.24 g TEMPO、2.4 g NaBr 和2 mL NaClO溶液加入到500 mL去离子水中，室温下用0.1 mol/L 的NaOH 溶液调节pH 值为10.0～10.5，搅拌反应4 h。反应结束后，加50 mL 乙醇终止反应，用0.1 mol/L的HCl酸化反应后的纸浆并用去离子水过滤洗涤5次。将所得的分散液超声分散15 min，冷冻干燥得到羧基化纤维素纳米纤丝（NFC）。

将冷冻干燥后的NFC 放入到四口烧瓶中，加入3 mol/L的HCL溶液100 mL，搅拌回流水解3 h，高速离心洗涤（5000 r/min，10 min），然后转移至透析袋（截留相对分子质量14000）透析3天，超声分散后定容，得到质量浓度为2 mg/mL CNC分散液。

1.4 FCNC的制备

取250 mL 2 mg/mL的CNC分散液（绝干质量0.5 g），超声分散30 min，用PBS 缓冲溶液将pH 值调至5.0，静置30 min 以完成CNC 上的羧基活化。加入EDC 0.315 g （1.61 mmol），30 min 后 加 入NHS 0.51 g（3.22 mmol），调节pH 值到7.2。然后再将0.1725 g（1.84 mmol）EADANI 溶于5 mL DMF，取1.25 mL 加入分散液中，室温下搅拌反应16 h。反应结束后，高速离心（5000 r/min，10 min），下层沉淀用水洗出，在透析袋中透析5 天，超声分散后得到质量浓度为3.05 mg/mL的FCNC分散液。

1.5 分析与表征

通过全数字超导NMR 光谱仪（AVANCE III HD，布鲁克有限公司） 分析样品，样品浓度为1×10-5mol/L，使用氘代甲醇作为样品溶剂，测试频率为400 MHz，接触时间为2 ms，转速为10 kHz，检测方法为CP/MAS。使用透射电子显微镜（TEM，JEM-1400TEM，日本电子株式会社）拍摄样品TEM图：将浓度为0.005 wt%的样品分散液超声分散3 min后，将分散均匀的溶液滴在涂有碳膜的300目铜网上，自然风干，采用乙酸双氧铀染色2 min，用滤纸吸去多余的染色剂，制好的样品在80 kV的加速电压条件下拍摄TEM 图像。采用功能水平X 射线衍射（Ultima IV，日本理学电机工业株式会社）进行测试以得到样品的X 射线衍射（XRD）谱图：以Cu Kα（λ=0.154 nm）为靶材，测试角在5°～40°之间，步长为0.05°，计数时间为300 μs。利用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR-650，天津东港有限公司）测定样品的FT-IR 光谱：样品真空干燥后在玛瑙研钵中研磨，通过溴化钾压片法制成合适大小的薄片，采用透射法测试红外光谱，扫描范围为650～4000 cm-1，扫描次数为32，间距为4 cm-1。采用双光束紫外可见分光光度计（TU-1900，北京普析通用仪器有限责任公司）检测CNC、EADA⁃NI 以及FCNC 的紫外吸收光谱。采用配备有fp-405-T01-FL 激发光源的光纤光谱仪（R4，上海复享仪器设备有限公司）测量样品荧光光谱，激发光波长为405 nm，狭缝宽度为2 nm。

1.6 金属离子检测

考虑到染料EADANI在CNC表面接枝前后的生色团和发色团没有发生结构变化，且实际测得EADANI接枝前后CNC的吸收光谱图基本未有变化，所以假设EADANI 最大吸收波长处的吸光度在接枝前后保持不变。基于此，根据EADANI的标准吸收曲线，定量出1 mg/mL FCNC 溶液的接枝染料EADANI 浓度为5×10-4mol/L。称取一定量的NaCl、AgNO3、Pb（NO3）2、Cu（NO3）2·3H2O、ZnCl2、Mg（NO3）2·6H2O、FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、K2Cr2O7作为金属离子源，分别用超纯水配制成浓度为2.5×10-4mol/L 的金属离子母液。FCNC 对金属离子的选择性荧光检测步骤如下：取1 mL 不同金属离子母液和164 μL 3.05 mg/mL FCNC 分散液配制混合液，用超纯水定容至5 mL，此时金属离子浓度为5×10-5mol/L，FCNC的质量分数为0.1 mg/mL（表面接枝染料EADANI 的浓度相当于5×10-5mol/L），通过光纤光谱仪测定水相中混合液的荧光发射光谱并记录最大荧光发射强度值。竞争性金属离子存在下的荧光检测实验步骤如下：取1 mL Fe3+母液和164 μL FCNC分散液，之后加入1 mL其余金属离子母液，用超纯水定容至5 mL，此时Fe3+和竞争性金属离子浓度均为5×10-5mol/L，FCNC的质量分数为0.1 mg/mL（表面接枝染料的浓度相当于5×10-5mol/L），通过光纤光谱仪测定水相中混合液的荧光发射光谱并记录最大荧光发射强度值。金属离子荧光传感检测实验均在室温（25℃）条件下进行。

2 结果与讨论

2.1 FCNC的制备

相比于先酸水解再TEMPO/NaClO/NaBr 氧化工艺，先通过TEMPO氧化再酸水解制备的CNC具有更高的羧基化程度［24-25］，实际测得羧基含量达1.5 mmol/g，高羧基含量有利于提高CNC基底的反应活性。本实验通过EDC/NHS 活化CNC 表面的羧基并与末端带有氨基的荧光染料EADANI 进行共价键结合，EADANI 和FCNC 的合成路线示意图如图1 所示。CNC 的高羧基含量不仅提高了基底的反应活性，同时还通过电荷排斥作用改善了CNC在水溶液中的分散性。EADANI染料在水中的最大溶解度为3×10-4mol/L，而通过共价键负载到CNC 上后，利用CNC 基底良好的亲水性和分散稳定性，EADANI 在水中的最大溶解度可达1.2×10-3mol/L，从而拓宽了有机荧光染料在水相介质体系中的应用。

2.2 FCNC的形态及结构分析

图1 染料EADANI(a)和FCNC(b)的合成路线示意图

图2 EADANI、CNC和FCNC的FT-IR谱图比较

图2 为EADANI、CNC 以及FCNC 的FT-IR 谱图。其中，EADANI 在3474、3444、3369 cm-1处分别出现了伯胺与仲胺的伸缩振动吸收峰，在2965和2922 cm-1处分别出现了甲基与亚甲基的伸缩振动吸收峰，在1680 cm-1处观察到酰亚胺的特征吸收峰，在1400～1600 cm-1之间则出现了萘环的特征吸收峰。CNC 与FCNC 在3338、2902、1050 cm-1处分别显示出纤维素的O—H、C—H 以及C—O 的伸缩振动吸收峰。由于酰胺键的形成，FCNC在1718 cm-1处的C=O特征吸收峰强度显著降低，同时在1678 cm-1处（肩峰）出现了酰胺键（O=C—NH）的特征吸收，表明EADANI 成功地接枝到CNC表面。

图3 是CNC（a）及FCNC（b）的TEM 图。从图3 可以看出，CNC 具有棒状结构，长度在100～300 nm 之间，宽度在10～25 nm 之间，尺寸较为均一，在水中的分散性和亲水性能良好。CNC 表面经共价键负载EADANI 染料得到的FCNC 尺寸形态较CNC 没有明显变化 （图3（b））。图4 为CNC 及FCNC 的XRD 谱图。由图4 可知，CNC 在2θ=22.56°处显示最强信号，在2θ=15.55°处显示宽信号，在2θ=34.39°处显示较弱信号，分别对应于CNC 晶体结构的（200）（110）和（004）晶面。利用结晶度指数（CrI）计算公式［26］（见式（1）），计算得CNC 与FCNC 的结晶度分别为74.4%和60.0%。可见，荧光染料EADANI 的共价键负载对于CNC结晶度有一定的影响。这可能是由于接枝EADANI 后的FCNC 亲水性下降，导致干燥后测试样品中水分降低引起的结晶度测量误差［27］和FCNC合成过程中对CNC结晶区的破坏作用共同造成的。

其中，I200是在2θ= 22.56°处的 （200） 晶面的强度，Iam是在2θ=18.59°处的晶面强度，其对应于纤维素中的无定形区域［28］。

图3 CNC（a）和FCNC（b）的TEM图

图4 CNC与FCNC的XRD谱图

2.3 FCNC光学性能分析

图5 （a）为EADANI、CNC 和FCNC 的UV-vis 吸收光谱图。由图5（a）可以看出，CNC在UV-vis区无特征吸收，而EADANI 在281 和446 nm 处显示出强吸收峰，FCNC 的UV-vis 吸收光谱基本与EADANI 相同，说明染料EADANI成功接枝到CNC表面且接枝过程对染料EADANI的UV-vis吸收光谱无明显影响。图5（b）为CNC、EADANI与FCNC的荧光发射光谱图。由图5（b）可知，CNC 无荧光信号，而EADANI 显示强荧光发射性能，发射峰位于540 nm，其斯托克斯位移达到了94 nm。FCNC 发射峰位置位于564 nm，斯托克斯位移达到118 nm，相较于EADANI 红移了24 nm，这可能是由于CNC表面的邻近羧基增加了染料局域环境的极性，从而增强了溶剂化效应［29］。

2.4 金属离子检测

图6（a）对比了FCNC 在溶液中检测不同金属离子的荧光发射强度最大值。从图6（a）可以看出，Fe3+对FCNC 有很强的荧光增强效果，荧光增强因子可达到9.5，而Fe2+、Mg2+、Zn2+、Pb2+、Cu2+对FCNC的荧光增强作用很弱，增强因子均在3 以下，其余金属离子Na+、Ag+、Cr6+对FCNC几乎没有荧光增强作用。上述现象可能的原因是Fe3+容易极化，溶液呈现相对较强的酸性，Fe3+极化后的离子半径适合与N，N-二甲基氨基中的N 原子配位形成相对稳定的络合物，使N，N-二甲基氨基供电子能力大幅下降，减弱或抑制光诱导电子转移（PET）过程，使FCNC 的荧光增强（见图7），相似的络合机理在文献［30-31］中也有报道。二价金属离子可能与N，N-二甲基氨基的络合能力较弱，而且自旋-轨道耦合以及电子或能量转移对荧光的猝灭作用也会抑制FCNC的荧光增强作用［32］；其余金属离子则可能难以与N，N-二甲基氨基络合，因此未显示出荧光增强效果［33-34］。上述现象表明，FCNC在水相中对Fe3+有良好的选择性和灵敏度。为了进一步考察FCNC 对Fe3+的选择性，研究了在竞争性金属离子存在条件下，FCNC 对Fe3+的检测性能，结果如图6（b）所示。从图6（b）可以观察到，在Fe3+存在的条件下，FCNC 与其他竞争性金属离子样品的荧光强度均有显著提高，增强效果与不含竞争性离子的混合液（FCNC+Fe3+）相近。在Cr6+存在条件下，Fe3+对FCNC荧光增强效果略有减弱，这可能是由于Cr6+与Fe3+螯合竞争所导致［35］，尽管如此，其荧光增强效果仍然比较明显，荧光增强因子大于5。上述结果表明，Fe3+对FCNC 的荧光增强作用基本不受竞争性金属离子的干扰影响，FCNC具有良好的荧光检测选择性。

图5 EADANI、CNC和FCNC的UV-vis吸收光谱图（a）和荧光发射光谱图（b）

图6 （a）FCNC在不同金属离子溶液中的最大荧光发射强度对比；（b）竞争性金属离子存在条件下FCNC/Fe3+混合液的最大荧光发射强度对比

图7 Fe3+对FCNC的荧光增强作用机理示意图

3 结 论

采用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）体系将N-（4-氨基苯基）-4-（N，N-二甲基乙二胺基）-1，8-萘酰亚胺（EADANI） 荧光染料成功接枝到纤维素纳米晶（CNC） 的表面，得到荧光纳米纤维素晶探针（FCNC），并通过透射电子显微镜（TEM）、X 射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）等分析手段对FCNC 的形态和结构进行了分析。与CNC 相比，接枝EADANI 后的FCNC 尺寸形态没有太大变化，与染料EADANI相比，FCNC的亲水性显著提高，同时其具有良好的荧光发射性能，斯托克斯位移达到118 nm。FCNC 在水溶液中可以选择性识别Fe3+，荧光增强因子达到9.5，竞争性金属离子的存在基本不会干扰FCNC对于Fe3+的检测灵敏度和选择性。FCNC对于水相体系中的荧光传感检测具有潜在的应用价值。