特发性少、弱精子症患者精液质量指标及辅助生殖妊娠结局相关性研究*

孙宝刚 管福来 曹井贺** 梁鲁南 董业浩 房 姣 杨爱军

1.济宁医学院附属医院（山东济宁 272000）；2.潍坊医学院

目前，世界范围内不育影响着近20%的夫妇，其中，男性因素约占50%[1]。随着临床先进诊断技术的应用，多数男性不育的病因已被确定，但仍有30%～40%病例尚无法探知其确切病因，被诊断为特发性男性不育症（包括特发性少精子症、弱精子症和畸形精子症）[2]。

资料与方法

一、研究对象

收集在我院生殖医学科就诊的132例特发性男性不育症患者为实验组以及50例已生育的成年健康男性为对照组，在我们的研究中，无论是常规体外受精（IVF）周期还是卵胞浆内单精子注射（ICSI）周期，双原核受精率的计算都是双原核受精卵子数除以获卵数。将132例患者分为IVF治疗周期组72例，ICSI治疗组60例纳入本项研究。

为尽量减少外变量的影响，回顾性研究对患者的入选条件进行了严格规定。特发性少弱畸精子症符合 WHO-5推荐标准诊断。无遗传性疾病史、无传染性疾病、无接触 X 光和有害化学物质史，排除先天畸形、睾丸发育不良、内分泌系统疾病、生殖道感染、隐睾症、睾丸萎缩；精路梗阻、精索静脉曲张等病史及其他可能导致男性不育症的，属原因不明确的特发性男性不育症。为减少女方因素对结果的影响，我们规定女方年龄在35岁及以下，继发不孕，不孕年限为1.5至8年，且第一次行IVF/ICSI治疗，仅有单纯输卵管因素，没有其他相关妇科病史和盆腔手术史,且至少获得了 5枚MII卵。

本项研究得到了我院生殖医学伦理委员会的批准。所有的研究对象均在自愿的前提下签署了科研知情同意书。

二、方法

（一）实验方法

1.精液常规分析。

2.计算机辅助精子分析（CASA）：采用计算机辅助精子分析仪(西班牙，SCA)检测精子密度、总数、各级运动精子百分率和数量等。

3.精子形态学分析（Diff-Quik法）：检测精子形态正常率=正常形态精子数/计数精子总数×100%

4.精子功能检查：依照 WHO 技术规范采集、处理和检测精液标本， 检测实验组与对照组相关精子功能指标水平。精子-透明质酸结合率；精子核蛋白不成熟率；精子DNA 碎片率，顶体酶检测均采用深圳市博锐德生物科技有限公司产品试剂盒，检测操作均按试剂盒说明书要求进行。

5.精子处理：将实验组与对照组的男性精液标本采用密度梯度分离法分离：其具体步骤为：取精子密度梯度分离培养基，吸取1mL下层（高密度）分离培养基置于离心管中，再吸取1mL上层分离培养基（低密度）缓慢地注于下层分离培养基的上面.两层培养基的中间形成一个清晰的界面，37℃培养箱复温。小心吸取1mL培养基化的精液覆盖于上层分离培养基的液面。以（300～600）×g的速度离心20min。移去所有的分层溶液，只剩底部的沉淀。加2～3mL洗精培养基，将沉淀混匀。200×g离心5min。移去上清，再加入洗精培养基，重复离心洗涤步骤。用0.5mL IVF受精培养基沉淀。进行精于计数和精子质量评估。将处理获得的精子调整密度至（50～300）×103/mL为宜，后置5%CO2、37℃、95%湿度培养箱待用。

（二）临床操作

控制性超促排卵 实验组与对照组女方均选择长方案超促排卵：于启动周期前次月经黄体中期肌注GnRH （达菲林1.33mg），月经第3天开始使用Gn促排卵，月经第6天起，行阴道B超检查卵泡和子宫内膜发育情况，并以此及时调整用药。直至有2～3个主导卵泡直径在18mm以上时，结合激素检测结果提示卵泡发育成熟，停用促排卵药物，于当晚8点注射hCG5000～10000u。注射hCG后34～36h在阴道B超引导下穿刺取卵，记录取卵数。

（三）受精及胚胎培养

实验组与对照组均采用常规的体外受精。受精后18h观察原核，出现2个原核和2个极体为正常受精卵，未出现两原核期（2PN）为受精完全失败。取卵后培养72h观察胚胎形态，将优质胚胎移植到宫腔内。胚胎移植后14d检测尿或血hCG阳性，移植后4～5周超声检查见胎心搏动为临床妊娠。移植时先选择常规受精来源的胚胎，若无常规受精来源胚胎则移植ICSI受精胚胎。

（四）胚胎按以下评分标准分级

形态学指标：4’-卵裂球大小均匀，碎片为≤5%；3’-卵裂球大小均匀或不等，碎片6%～20%；2’-卵裂球体积相等或不等，碎片21%～50%；1’-卵裂球少，碎片＞50%。1、2级胚胎在发育过程中出现下列情况，胚胎评级时在形态学基础上降一级：（1）授精20h内未见到原核，48h证实为延迟受精的胚胎。（2）取卵后48h超过8细胞或72h未超过5细胞。正常受精4、3级胚胎为优质胚胎。

（五）计算公式

1.受精率=正常受精卵数/卵-冠-丘复合体数×l00%。

2.优质胚胎率=优质胚胎数/正常受精卵数×l00%。

3.着床率= B超观察到的妊娠囊数/移植胚胎数×100%。

4.临床妊娠率=临床妊娠例数/移植周期数×l00%。

5.生化妊娠率= 生化妊娠周期数/妊娠周期数。

6.流产率= 孕28周前流产周期数/临床妊娠周期数。

7.早产率= ART受试者在妊娠满28周至不满37周期间分娩周期数/分娩周期数。

三、统计学处理

实验数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析。计量资料用±s表示，比较采用单项方差分析；计数资料用率（比值）表示，比较应用卡方检验。P＜0.05认为差异有统计学意义，P＜0.01差异有显著统计学意义。

结 果

收集在我院生殖医学科就诊的132例特发性少、弱精子症患者列为实验组。并将正常生育组50例男性纳入对照组。

一、实验组与对照组一般资料比较

比较实验组与对照组患者：男、女方年龄、不孕年限、窦卵泡数、女方基础 FSH、女方基础 LH、hCG 日 E2、hCG 日子宫内膜厚度差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

二、实验组与对照组精液质量比较

实验组与对照组相比，精液参数中，精液量差异无统计学意义（P＞0.05）。精子浓度、正常形态率、精子前向运动率（PR,%）、对照组高于实验组，差异有统计学意义，精子非前向运动率（NP, %）实验组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 实验组与对照组一般资料比较

表2 实验组与对照组患者基本情况比较

三、实验组与对照组精子功能的比较

实验组有10例精子浓度过低，由于无法继续进行精子功能试验，故将此10例患者剔除出去。其中对比两组精子功能指标，实验组的顶体酶活性、精子-透明质酸结合率小于对照组，实验者组DNA碎片、核蛋白组型大于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 实验组与对照组患者精子功能比较

四、实验组与对照组体外受精-胚胎移植（IVFET）和胞浆内单精子注射-胚胎移植（ICSI-ET）妊娠结局的比较

IVF治疗者，实验组受精率、卵裂率、优质胚胎率、着床率、生化妊娠率、临床妊娠率小于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。ICSI治疗者，实验组受精率、卵裂率、优质胚胎率、着床率、生化妊娠率、临床妊娠率与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

六、实验组与对照组对子代影响

实验组与对照组相比，两者的早产率、后代出生体质量、双胎妊娠率、男婴比例、出生缺陷率两两比较后显示无统计学差异（P＞0.05），见表6。

表4 实验组与对照组IVF-ET妊娠结局的比较

表5 实验组与对照组ICSI-ET妊娠结局的比较

表6 实验组与对照组对子代影响的比较

讨 论

当前，特发性男性不育症会影响其发生发育的遗传物质紊乱成为目前及将来人们关注的焦点，目前特发性少弱畸精子症对精子质量精子功能以及辅助生殖结局的影响研究很少。为了更好地衡量男性生育能力和预测生殖结局，临床需要准确地测定精子功能。本研究显示：与正常人相比，特发性不育者的精子浓度、总活力以及正常形态率明显减少。但是精液量并无显著性差异，然而对比特发性少、弱精子症患者与正常生育组两组精子功能指标时发现：特发性少、弱精子症患者组的顶体酶活性、精子-透明质酸结合率小于正常生育组，特发性少、弱精子症患者组DNA碎片、核蛋白组型大于正常生育组，差异具有统计学意义，这与Muratori等[3,4]研究相似，并且Aktan等[5]研究也发现特发性少、弱精子症患者精子DNA损伤与其高水平的ROS有关，高水平的ROS容易导致特发性少、弱精子症男性精子核蛋白赖氨酸-精氨酸转换障碍，从而导致精子DNA 的易损性增大，或者是高水平的ROS可以直接攻击精子DNA，引起精子DNA片段断裂，从而导致精子DNA碎片率增高，精子卵子结合障碍，最终导致精子功能降低。因此提示：特发性少、弱精子症患者除了精液质量异常之外有可能合并精子功能异常，因此针对特发性少、弱精子症患者在常规精液分析的基础上进行精子功能相关指标检测，可以揭示一部分特发性少、弱精子症患者的病因，并因此可以采取针对性的治疗，或者为下一步采取辅助生殖方式的选择以及治疗结局提供参考。

随着IVF-ET以及ICSI在男性不育患者中的应用，对于一些特发性少、弱精子症男性患者可以通过此类措施而获得生育。但是这类技术的应用绕过了自然受精过程中对精子的自然选择过程，从而对辅助生殖妊娠结局以及对出生后代是否会产生不良的影响，关于这方面的问题目前仍不明朗。

为了更准确反映特发性少、弱精子症患者对IVF/ICSI-ET结局的影响，我们将研究对象分为IVF诊疗组以及ICSI治疗组，来分析特发性少、弱精子症患者对IVF/ICSI-ET结局的影响。本研究中，在实行IVF诊疗组当中特发性少、弱精子症患者的受精率、卵裂率、优质胚胎率和临床妊娠率低于正常男性患者，流产率高于对照组。而在实行ICSI治疗组，特发性少、弱精子症患者的受精率、卵裂率、着床率、优质胚胎率、临床妊娠率和流产率与正常患者相比，无明显差异，这与Setti等的研究[6]相似。有研究[7]分析，认为精子DNA碎片的增加对辅助生殖结局会产生不良影响，它可能会导致精卵结合障碍从而引起受精率降低，胚胎卵裂率以及胚胎质量下降，最终会导致妊娠率降低以及流产率升高。应用ICSI治疗的同时结合纠正不良生活习惯（诸如吸烟、酗酒、服用生殖毒性药物等），服用抗氧化药物（如维生素C、维生素E、辅酶Q10等药物[9]），则可以减少精子DNA异常精子的注射，可能因此会改善辅助生殖技术临床结局[9]。我们的研究也发现，特发性少、弱精子症患者组与正常生育组相比，两者的早产率、后代出生体质量、双胎妊娠率、男婴比例、出生缺陷率两两比较后显示无统计学差异。而Fernández-Gonzalez等[10]通过动物研究发现雄性精子DNA碎片化增加可以引起早产率增加以及后代癌症以及先天性畸形的风险增加，这可能是研究的对象不同，或者所采用的研究方法不同所致，这需要今后更大样本、更系统的采用回顾性研究，以期为临床上对此类患者进行生育力评估、治疗手段的选择、胚胎植入前遗传学诊断的选择和妊娠结局的预测以及优生优育工作等提供依据。

综上所述，在男性不育诊疗过程中，对特发性少、弱精子症患者进行精子功能检查有其必要性，充分评估其生育能力，这将有助于其选择更加合理的生育方式。对于 IVF 治疗结局不良的特发性少、弱精子症患者， 实行ICSI 受精可能会改善其助孕治疗结局。然而特发性男性不育往往涉及多个因素，因此对其研究依然任重道远。

参考文献

1 J arow JP, Sharlip ID, Belker AM,et al.Best practice policies for male infertility.J Urol2002; 167(5): 2138-2144

2 Dohle GR, Diemer T, Giwercman A,et al.Guidelines on male infertility[R/OL].European Association of Urology2010; 171(2): 246-250

3 Muratori M, Marchiani S, Maggi M,et al.Origin and biological significance of DNA fragmentation in human spermatozoa.Front Biosci2006; 11(3): 1491-1499

4 Laberge RM, Boissonneault G.On the nature and origin of DNA strand breaks in elongating spermatids.Biol Reprod2005; 73(2): 289-296

5 Aktan G, Doğru-Abbasoğlu S, Küçükgergin C,et al.Mystery of idiopathic male infertility; is oxidative stress an actual risk?.Fertil Steril2013; 99(5): 1211-1215

6 Setti AS, Figueira RC, Braga DP,et al.Intracytoplasmic morphologically selected sperm injection is beneficial in cases of advanced maternal age: a prospective randomized study.Eur J Obstet Gyneclo Reprod Biol2013; 171(2):286-290

7 Simon L, Murphy K, Shamsi MB,et al.Paternal influence of sperm DNA integrity on early embryonic development.Hum Reprod2014; 29(11) : 2402-2412

8 Ni W, Xiao S, Qiu X,et al.Effect of sperm DNA fragmentation on clinical outcome of frozen-thawed embryo transfer and on blastocystformation.PLoS One2014; 9(4): e94956

9 商学军, 陈亮, 夏欣一, 等.男性生殖遗传学检查专家共识.中华男科学杂志 2015; 21(12): 1138-1142

10 Fernández-Gonzalez R, Moreira PN, Pérez-Crespo M,et al.Longterm effects of mouse intracytoplasmic sperm injection with DNAfragmented sperm on health and behavior of adult offspring.Biol Reprod2008; 78(4):761-772