血清miRNA-107检测在前列腺癌诊断与预后判断中的价值

罗振国 邓勇泉 陈向锋 迟宝进 陶 然 王 凯

1.佳木斯大学附属第一医院泌尿外科（黑龙江佳木斯 154003）；2.上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科

外周血miRNA作为肿瘤标志物在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌等研究中已经取得一定的成果[1,2]。本研究采用实时荧光定量PCR检测前列腺癌（PCa）患者和前列腺增生（BPH）患者血清miRNA-107的表达水平，研究其对前列腺癌诊断与预后的价值，并分析其与 PCa临床病理参数的相关性。

材料和方法

一、临床资料

收集2015年10月至2017年10月期间在我院泌尿外科经病理活检确诊的 PCa 和 BPH 患者术前血清。其中PCa患者30例，年龄62～91岁，平均年龄为（77.8±7.4）岁；BPH 患者30例，年龄63～88岁，平均年龄（75.3±6.0）岁。所有患者术前未行任何治疗。对可能影响miRNA表达的慢性疾病患者不纳入本次研究。病理分级依据 2003年WHO前列腺癌病理组织学分类标准Gleason评分，肿瘤分期按AJCC的TNM系统。两组研究对象年龄的差异均无统计学意义（P＞0.05）。采集标本前获得患者知情同意和我院伦理委员会批准，所有的血清标本保存在-80℃。PSA检测由我院检验科完成。

二、方法

1. RNA提取：取患者血清300μL，用 mir VanaTPAISTMmiRNA 试剂盒（Applied Biosystems）提取总RNA。按照ABI公司miRNA提取试剂盒分离提取miRNA，严格按照试剂盒说明方法步骤进行逆转录。

2.实时荧光定量PCR检测（qRT-PCR）：以总RNA 5μL为模板，应用Taq Man MicroRNA Reverse Transcription 试剂盒（ABI）进行反转录，总反应体系为15μL，反应条件如下：16℃30min，42℃ 30min，85℃5min，反转录引物miRNA-107特异性的茎环引物（Taq ManMicroRNA Assay ABI），其中上游序列为:5'-AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA-3'，下游序列:3'-AUAGCCCUGUACAAUGCUGCUUU-5'；内参基因上游序列:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，下 游 序 列: 3'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-5'，miRNA-107反转录引物、PCR引物和探针分别来自ABI生物公司TaqMan MiRNA RT Kit和TaqMan MiRNA Assay Kit。荧光定量PCR总反应体系为20μL，反应条件为：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。所有反应均在ABI 7500实时定量PCR仪上完成，每个样本重复3次，以U6为内参基因。采用 2-ΔCt计算 miRNA-107的相对定量表达水平，其中 ΔCt = CtmiRNA-107-CtU6。

3.统计学处理：应用 SPSS 17.0 统计软件分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用两独立样t检验，多组间比较采用单因素ANOVA分析和 LSD-t检验。用SPSS 17.0 软件绘制ROC曲线。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、miRNA-107在前列腺癌、良性前列腺增生患者血清中的表达水平

PCa、BPH患者血清 miRNA-107的相对表达水平见图1，PCa 组miRNA-107表达水平（15.19±4.44）较BPH组（9.66±3.97）增加明显，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 miRNA-107在前列腺癌组及前列腺增生组中的表达

二、ROC 曲线分析

miRNA-107对前列腺癌的诊断价值用 SPSS 17.0软件构建ROC曲线显示miRNA-107能够较好地区分前列腺癌与BPH，见图2，ROC曲线显示，miRNA-107区分前列腺癌和BPH的ROC曲线下面积（AUC）为0.806（曲线A），95%置信区间为（0.698～0.913），敏感度和特异性分别为66.7%和83.3%；PSA联合miRNA-107区分PCa和BPH的ROC曲线下面积为0.912（曲线B），95%置信区间为（0.839～0.985），敏感度和特异性分别为80.0%和86.7%。

图2 ROC曲线

三、miRNA-107表达水平与 PCa 临床特征的相关性

miRNA-107的表达水平与PCa患者的年龄差异无统计学意义（P＞0.05），Gleason 评分≥8分组与＜8分组miRNA-107的表达量分别为17.05±3.61和10.86±2.96，差异有统计学意义（P＜0.01）。血清miRNA-107表达水平与临床分期相关，随着临床分期的增加，miRNA-107的表达水平增加，差异具统计学意义（P＜0.01）。此外，骨转移的PCa miRNA-107表达量与未转移者相比增加，差异有统计学意义（P＜0.05），miRNA-107表达量与血清PSA水平显著相关（P＜0.05），见表1。

讨 论

miRNA是一类非编码、长度约为18～25nt的单链小RNA，miRNA参与细胞重要的生理病理变化过程，并且在研究中发现许多恶性肿瘤中都观察到miRNA的异常[2]。Lawrie 等[3]第一个证实表明血清中存在肿瘤特异性miRNA，他们发现弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的血清中miRNA-21表达量明显高于正常对照组，并且miRNA-21的表达水平与患者的生存率相关。近来Chen等[4]发现血浆microRNA表达谱可作为PCa非侵入性的标志物，并且let-7c、let-7e、miRNA-30c、miRNA-622和miRNA-1285等5个miRNAs 能够准确地区分PCa和BPH（AUC=0.924）。Chen等研究[5]显示miRNA-107通过抑制let-7 家族促进肿瘤的生长，起“癌基因”的作用。近期，Bryant等[6]应用qRT-PCR分析了PCa患者与正常对照血浆miRNA，筛选出12种异常表达的miRNA，其中miRNA-107在PCa中明显高表达（AUC＝0.62），并且在PCa患者尿液中也发现了高表达的miRNA-107。本研究通过qRTPCR检测PCa、BPH 血清中miRNA-107的相对表达水平，发现miRNA-107在PCa中高表达，能较好地区分PCa、BPH，AUC为0.806,与Bryant等[6]研究结果相一致。PSA联合miRNA-107区分Pca和BPH的AUC为0.912,敏感度和特异性分别为80.0% 和86.7% 。

表1 前列腺癌miRNA-107表达量与临床特征的相关性（±s）

表1 前列腺癌miRNA-107表达量与临床特征的相关性（±s）

临床特征 n miRNA-107的表达( 2- ΔCt×10-4)量统计量 P值年龄(岁)≤70 5 14.30±2.11 t＝0.483 ＞0.05＞70 25 15.37±4.79临床分级T1 4 8.00±1.20 F＝52.01 ＜0.01 T2 6 12.36±0.64 T3 11 15.17±1.62 T4 9 20.31±2.49 Gleason评分＜8 9 10.86±2.96 t＝4.524 ＜0.01≥8 21 17.05±3.61骨转移是6 19.46±2.35 t＝2.963 ＜0.05否24 14.12±4.21 PSA ρB (ng•mL-1)≤10 8 10.41±3.23 t＝4.015 ＜0.05＞10 22 16.65±3.70

本研究还发现 PCa 患者血清miRNA-107水平与Gleason评分相关，Gleason评分＞8的 PCa 患者血清miRNA-107水平明显增加；此外miRNA-107的表达水平随着临床分期的增加而增加；并且骨转移的PCa患者血清miRNA-107显著高于未转移者。Bryant等[6]发现转移性PCa与miRNA-107水平相关，转移性PCa miRNA-107水平高于未转移者。Brase等[7]表明miRNA-107 是高风险肿瘤的标志物，循环miRNA-107水平与 Gleason评分相关。上述研究结果提示，血清miRNA-107可作为PCa诊断和预后的分子标志。近年来发现循环miRNA不仅可作为肿瘤诊断和预后判断的标志物，还可以作为个性化治疗的一种潜在方法[8]。经直肠超声引导下穿刺活检是我国PCa诊断的金标准[9]，随着PSA在临床上的广泛应用，PCa的诊断及治疗技术不断完善，PCa的综合治疗趋于成熟，但是25%～50%的患者仍然面临着生化复发问题，即术后PSA水平的升高[10]。我国逐步迈入老龄化社会，人均寿命的不断增长，生活习惯及饮食结构的不断改变，PCa发病率不断攀升，此外中老年男性缺乏泌尿外科相关的科普知识，出现排尿梗阻等不适症状时往往未及时就诊，我国PCa患者确诊时多属晚期，常常导致预后差、死亡率高的现状，因此对于中老年男性应提倡PCa的早期筛查。PSA联合检测血清miRNA-107对于PCa的临床诊断意义重大，可以增加前列腺穿刺活检的阳性率，避免不必要的前列腺穿刺等，但仍需后续的相关实验研究。根据miRNA-107的具体含量来辅助评定临床中诊断证据不足或者难以诊断的患者是否可行PCa的相关治疗，完成PCa的早发现、早诊断、早治疗，对提高患者治愈率和预后生活水平有重要意义。

综上所述，PCa患者血清中可以检测到miRNA-107高表达，可以作为PCa的早期诊断及评定预后的标记物之一，联合PSA检测的结果，对于PCa的临床早期诊断具有协同作用，或许对PSA水平增高但穿刺活检为阴性的患者有特殊的意义，但相关数据仍需进一步的实验加以验证。由于本研究样本量偏小，会产生偏倚，需进一步扩大样本量及多中心的患者群体中进一步验证，为PCa的早期诊断、疗效判断及预后分析提供有力武器。

参考文献

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3 Lawrie C H, Gal S, Dunlop HM,et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma.Br J Haematol2008; 141(5): 672

4 Chen ZH, Zhang GL, Li HR,et al.A panel of five circulating microRNAs as potential biomarkers for prostate cancer.Prostate2012; 72(13): 1443

5 Chen PS, Su JL, Cha ST,et al.miR-107 promotes tumor progression by targeting the let-7 microRNA in mice and humans.J Clin Invest2011; 121(9): 3442-3455

6 Bryant RJ, Pawlowski T, Catto JW,et al.Changes in circulating microRNA levels associated with prostate cancer.Br J Cancer2012; 106(4): 768

7 Brase JC, Johannes M, Schlomm T,et al.Circulating miRNAs are correlated with tumor progression in prostate cancer.Int J Cancer2011; 128(3): 608-616

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9 汪洋, 艾热提•阿皮孜, 孙宝澍, 等.MRI与TRUS联合定位穿刺活检在PSA灰区患者前列腺癌诊断中的研究.中国男科学杂志 2017; 31(5): 47-49

10 翟明慧, 赵化荣.前列腺癌根治术后生化复发的诊治进展.现代肿瘤医学 2014; 22(7): 1721-1723