二仙膏联合胰激肽原酶对重度少精子症患者精子质量及ICSI结局的影响*

张新东 金保方 李晓琴 孙大林 杨文涛 李群生 刘建国 赵红乐

1.南京大学医学院附属鼓楼医院生殖中心（南京 210008）；2.东南大学附属中大医院中西医结合男科；3.广西中医药大学附属瑞康医院男科；4.陕西省中医医院男科

随着体外受精胚胎移植（IVF-ET）技术的发展，精液常规参数已经不足以准确评价男性的生育能力。卵胞浆内单精子显微注射 （intracytoplasmic sperm injection,ICSI）技术的出现，使得对精子密度的要求下降，精液常规参数对ICSI结局的预测价值有局限性。近年来，许多研究认为精子DNA碎片指数（DNA fragmentation Index,DFI）可以更客观，更准确的评估男性生育能力，对预测IVF-ET的结局具有重要的参考价值[1]。

由于精子DNA损伤的病因及机制至今没有完全阐明，目前，对于DFI增高还缺乏特异性的治疗手段。大量研究表明，睾丸微循环障碍是精子发生异常的病理基础和病机之一[2]，由于代谢不良，超氧自由基异常增加，精子DNA遭受氧化应激损伤。临床上我们应用能够补肾抗氧化作用的中药二仙膏联合具有改善微循环的胰激肽原酶（怡开），治疗DFI增高的重度少精子症患者，取得了较好的临床效果，可以显著降低DFI，而且在进行ICSI助孕后，可以显著增加优质胚胎数，改善妊娠结局。现报告如下。

临床资料及方法

一、研究对象

本研究由东南大学附属中大医院、南京大学医学院附属鼓楼医院、广西中医药大学附属瑞康医院、陕西省中医医院多中心搜集2018年3月～2019年3月因男方重度少精子症而拟行ICSI助孕的患者，采用流式细胞仪检测DFI参数，DFI异常增高者作为研究对象。纳入标准：（1）婚后未避孕1年以上未育拟行ICSI治疗者；（2）精子浓度≤5×106/mL；（3）DFI≥20%；（4）女方（配偶）年龄≤38岁，且卵巢功能（生殖内分泌、基础卵泡计数）、子宫及内膜基本正常或者是单纯因输卵管梗阻因素不孕者。

排除标准：（1）男方染色体异常或精子发生基因缺失者；（2）男方年龄≥50岁；（3）男方有乙肝、生殖器疱疹等传染性疾病患者；（4）男方有前列腺炎、尿道炎、精囊炎等泌尿生殖系统感染患者；（5）男方接触辐射或高温工作环境患者；（6）男方有精索静脉曲张的患者。

二、分组及治疗方法

采用分层随机数字表法，将患者分为观察组和对照组。观察组80例口服二仙膏（山东广育堂国药有限公司），20g/次，2次/d，同时加服怡开（胰激肽原酶，常州千红生化制药股份有限公司）240U/次，3次/d；对照组60例口服维生素E（VE）（青岛双鲸药业有限公司）100 mg/次，3次/d。研究开始前，征得患者的知情同意权。两组患者每治疗一个月，复查一次精液常规参数及DFI，若DFI已经在正常范围（≤15%），则提前进入ICSI周期。药物最多服用3个月，观察并统计最终疗效。

三、超排卵方案及胚胎质量评定

所有女性患者均采用GnRH-a长方案，于降调理想后，注射促性腺激素（Gn，果纳芬），取卵后3～4h手淫排精，优化精子后行ICSI，受精后72h后进行胚胎形态学评估，选择1～2个胚胎进行移植，剩余胚胎冷冻保存。

胚胎质量评定标准：Ⅰ级：胚胎卵裂球大小均匀，透明带完整，胞质碎片≤5%，胞质均匀透明。Ⅱ级：卵裂球大小稍不均匀，胞质碎片5%～20%，胞质存在少量空泡。Ⅲ级：卵裂球大小明显不均匀，形状不规则，胞质碎片20%～50%，可能存在胞质颗粒不均或大量空泡。Ⅳ级：卵裂球大小严重不均匀，胞质碎片＞50%，存在胞质颗粒不均或大量空泡。其中Ⅰ-Ⅱ级为优质胚胎，Ⅰ-Ⅲ级为可移植胚胎，Ⅳ级为不可移植胚胎。

四、观察指标及数据分析

检测并记录两组患者治疗前后精液常规参数及DFI值，分别进行组内及组间对比，分析药物治疗效果。进行ICSI助孕后，记录两组患者受精率、优胚率及临床妊娠成功率，分析药物对妊娠结局的影响。

妊娠结果判定：胚胎移植14d，HCG升高者（＞10mIU/mL）为生化妊娠，移植4周，B超检查显示胎心搏动者确认为临床妊娠。如果怀孕，随访至胎儿出生。

五、统计学方法

采用SPSS 24.0统计软件，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，治疗前后组内比较采用配对样本t检验。计数资料采用卡方检验，累计频数＜5时，采用Fisher精确概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般资料对比

两组患者年龄、治疗前精液常规参数、DFI值以及女方（配偶）年龄、基础卵泡（Antral Follicle Count,AFC）计数比较均无统计学差异（P＞0.05，表1）。

表1 两组患者一般资料对比

二、治疗前后精液参数及DFI比较

观察组80例患者治疗期间脱落5例，对照组60例患者脱落4例。观察组治疗后，精子浓度及活力都有显著提升，对照组治疗前后，精子浓度及活力无明显变化。观察组 DFI值由治疗前的39.16±11.52降低至9.86±7.32，组内比较有统计学差异（P＜0.05）；对照组 DFI由治疗前的39.35±11.62降低至23.54±9.12；观察组与对照组相比，治疗后 DFI参数（9.86±7.32 vs 23.54±9.12）有显著性差异（P＜0.01，表2）。就治疗效率来讲，观察组有34.7%（26例）患者在治疗1个月后DFI恢复正常（＜15%），而对照组在治疗1个月后仅有14.3%（8例）的患者恢复正常。这说明二仙膏联合怡开的治疗效率比VE更加高效，这也为患者尽快进入ICSI周期争取了时间。

表2 治疗前后精子质量对比

三、患者配偶获卵数、优胚数及临床结局比较

两组患者均采用ICSI助孕治疗，配偶获卵数、受精率无显著性差异。观察组优胚率显著高于对照组，分别为 5.72±1.45、3.16±1.58，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。临床妊娠率比较，观察组和对照组分别为65.3%，60.7%，两组对比差异无统计学意义（P＞0.05）。从临床结局来看，观察组流产3例，对照组流产6例，两组对比有统计学差异（P＜0.05，表3）。

表3 配偶获卵数、优胚数及临床结局

讨 论

精子DNA损伤程度（DFI）是评价精液质量和预测男性生育能力的重要指标，生殖系统疾病、环境污染、年龄、药物、感染、吸烟、放化疗、睾丸温度升高等均可造成精子DNA损伤。精子DNA完整性对于父系基因遗传给子代至关重要，如果进入卵细胞的精子DNA受损会影响胚胎的发育潜能、胎儿的生长发育等。精子DNA损伤可能与受精率、胚胎发育、种植率、妊娠率、流产率以及子代的先天性异常等有关[3]。

目前关于精子DNA损伤的病因依然没有完全清楚，但是普遍认为各种因素导致的睾丸损伤（比如精索静脉曲张、睾丸炎和睾丸外伤等），其最终的病理特征均表现为睾丸微循环障碍。由于代谢不良，超氧自由基异常增加，而氧自由基介导的氧化应激反应在精子DNA损伤过程中起着关键作用[4]。精子细胞膜富含多聚不饱和脂肪酸，易受到活性氧自由基（reactive oxygen Species,ROS）攻击并引起脂质过氧化反应。精子膜的流动性和完整性受到不同程度的损伤，导致精子核DNA变性或者断裂。同时ROS攻击精子核内DNA，使其不能正常包装和修复，导致DNA断裂、碱基修饰及染色质交联异常。

针对DFI异常增高，目前还没有推荐性的治疗药物。根据精子DNA损伤发生的过程，可以推断睾丸微循环障碍以及氧化应激损伤可能是精子DNA碎片增加的主要发生机制，而改善微循环已经被作为男性不育的基础性治疗方法写入中华医学会男科学分会 《中国男科疾病诊断与治疗指南（2016版）》。据此，我们在临床运用补肾养血抗氧化及改善睾丸微循环的治疗理念，联合使用二仙膏（补肾养血抗氧化）和胰激肽原酶（改善微循环），降低ICSI患者的DFI参数，探讨这种治疗方法的有效性，为临床治疗DFI异常增高，提供一种诊疗思路和行之有效的方案。

中医学认为“肾藏精，主生殖”、“精血同源”，并在男子不育症的治疗方面，积累了丰富的经验。目前认为补肾养血中药一般都具有抗氧化及延缓衰老的作用[5]。二仙膏是在著名古方龟鹿二仙膏基础上加味制备而成，已成功申请国家非物质文化遗产。龟鹿二仙膏首见于《医方考·虚损劳瘵门》，由鹿角、龟板、枸杞子、人参四味中药组成。此方以温肾益精的鹿角与滋阴补血的龟板二药作为主药，辅以补益生津的枸杞子和人参，四药合用，性味平和。其功能主治为：“男妇真元虚损，久不孕育；男子酒色过度，消烁真阴，妇人七情伤损血气，诸虚百损，五劳七伤。”二仙膏在此基础上加入熟地黄、何首乌、沙苑子、山药、黄芪、五味子、远志、牛膝、丹参、核桃仁、牛鞭、黑芝麻，增强了补肾填精功效，并通过益气养血，达到精血互补的作用。前期的研究表明[6]，二仙膏可以通过提高免疫细胞因子的表达，改善机体的免疫功能，而机体的免疫功能和氧化应激密切相关，共同维护人体的内环境稳态。在炎症过程中，免疫细胞产生一系列的炎症因子如细胞因子和反应性ROS对于消除病原是非常关键的，但过量ROS氧化血清白蛋白，进而诱导自身抗体合成，引发系统功能紊乱，产生疾病。某些细胞因子还可抑制氧化应激，如TNF-α激活NF-κB，上调锰超氧化物歧化酶（MnSOD）和铁蛋白重链（FHC）表达，清除过量 ROS，这是 ROS 和 NF-κB 交联调控免疫系统和氧化应激的重要途径[7]。现代药理学研究也表明[8-10]，二仙膏中的多种成分均有抗氧化作用。

胰激肽原酶（pancreatic kininogenase）又称胰激肽释放酶、血管舒缓素，是激肽系统的一个重要组成部分，属蛋白水解酶类，具有扩张毛细血管，增加毛细血管血流量，改善微循环和器官代谢的作用。胰激肽原酶广泛存在于生殖系统的各种组织和体液中，通过刺激前列腺素PGE2的生成，增加睾丸和附睾的血流量[11]，改善末梢血液循环，从而抑制氧化应激，减少ROS的产生[12]；此外，通过增加睾丸的血流量，改善生精小管的管状结构和间质组织的营养，刺激Sertoli细胞的生长，促进睾丸组织核酸的合成，为精子发生提供理想的生精微环境[13,14]。

鉴于此，本研究联合使用二仙膏和怡开，治疗DFI增高的重度少精子症患者，结果发现，治疗后观察组精子浓度明显升高，精子DFI值显著下降，与对照组相比差异具有统计学意义。就时间效率而言，观察组的治疗效果更快，有34.7%的患者，在服用药物1个月后，DFI即恢复正常，为患者进入ICSI周期节约了时间成本。

患者经过ICSI助孕后观察其结局，结果发现，在配偶获卵数相似的情况下，观察组优胚率明显高于对照组。临床妊娠率比较，观察组高于对照组，但无统计学差异。尽管两组患者的临床妊娠率差别不大，但是考虑到鲜胚移植的妊娠率仅有60%左右，以及部分患者有再次生育的需求，那么观察组拥有更多优质胚胎，为下次移植及再次生育做好了胚胎储备。就最终妊娠结局而言，观察组流产3例（4.0%），对照组流产6例（10.7%），观察组有更好的临床结局。

总之，本研究的结果表明，通过改善睾丸微循环和补肾抗氧化治疗可以显著降低不育症患者精子DNA碎片率，增加优胚率，有利于IVF结局。因此，这一诊疗理念值得临床推广应用，并且迫切需要对其作用机制进行进一步深入研究。