传染性蛋白的“负面”和“正面”（8）

朱钦士（美国南加州大学医学院）

（上接2018年第10 期第10页）

3.3 Prion 型的蛋白为休眠中的卵细胞储存“嫁妆”卵细胞生成后，常要等待很长的时间才能被使用。 例如，人的卵细胞在女孩尚未出生时就形成了，要过十几年，甚至几十年后才成熟并被使用，在此之前卵细胞就一直处于休眠状态。 一个有趣的现象是，从线虫、果蝇到脊椎动物，卵细胞在形成的初期都会在细胞内生成一个高密度的团状物，界限清晰而又没有膜包裹，称为“巴比阿尼体”（Balbiani body）。 它只存在于休眠期的卵细胞中，在卵细胞成熟时则消失。

检查巴比阿尼体的组成成分，发现它含有RNA 和线粒体，被认为是卵细胞在休眠状态时储存RNA 和线粒体的一种结构，其作用是保护这些RNA 分子和线粒体，以便在卵细胞成熟受精后使用，有点像卵细胞的“嫁妆”或者“细软”。

形成巴比阿尼体结构的主要是一种蛋白质，在斑马鱼中称为“布基球蛋白”（Bucky ball），在青蛙卵中称为Xvelo。它们的氨基端都含有能转变为横向β-折叠，形成Prion 型结构的功能域。它们形成的聚合物能抵抗高浓度的盐溶液，在高温下也不解离，且能结合硫黄素T，说明它们形成的聚合物具有Prion 型的结构。

敲除斑马鱼的Bucky ball基因，或青蛙的Xvelo基因，卵细胞中就没有巴比阿尼体形成，说明这些蛋白对于巴比阿尼体的形成是必要的。 用其他传染性蛋白的Prion 功能域取代这2 种蛋白的Prion 功能域，这样生成的蛋白虽然也能形成Prion 型的聚合物，但是却不能形成巴比阿尼体，也不会进入已经形成的巴比阿尼体，说明形成巴比阿尼体的蛋白有自己特异的Prion 功能域，形成的聚合物也有自己的结构和性质，是其他的传染性蛋白无法取代的。

3.4 Prion 型的蛋白形成“分子手铐”抑制质粒DNA的复制 质粒（plasmid）是染色体外的环状DNA，主要存在于细菌中。 质粒常带有对细菌有益的基因，例如抵御抗菌素的基因。 质粒能自我复制，且通过细菌之间由细丝形成的通道从一个细菌传播至另一个细菌。

质粒既然可自我复制，一个细菌也就可含有多个质粒。细菌细胞中质粒的数量是受控制的，既不能太少，也不能太多。 假单孢杆菌（Pseudomonas syringae）所含的质粒称为Psudomonas pPS10，其复制过程受一个蛋白RepA（replication protein A）的控制。RepA 既能让质粒复制，又不让它过分复制，其机制就包括RepA 的Prion 形式。

RepA 蛋白由质粒自身的DNA 编码，由320个氨基酸残基组成。 它含有2 个WH（winged helix）功能域WH1 和WH2，都由α－螺旋组成。 在α-螺旋结构不变的情况下，一个RepA 分子上的WH1 域能与另一个RepA 分子上的WH1 域结合，形成RepA 的同质二聚体。 WH2 域含有结合质粒复制起始点DNA 序列的界面。 在RepA 二聚体通过WH2 域，结合到质粒的复制起始点时，二聚体解离，变成单体。 单体的RepA 能作为质粒复制的启动蛋白，开始质粒的复制。

RepA 蛋白单体与质粒DNA 的结合也改变其WH1 功能域的结构，使其转变为横向的β-折叠，而WH2 域的结构并不改变，仍然能结合DNA。 结合在2 个质粒上的RepA 蛋白单体通过变为Prion型结构的WH1 功能域彼此结合，将质粒复制完成后形成的2 个质粒连在一起，像一根绳子拴住2个环，类似手铐的形状，所以这种情形叫做将2 个质粒“铐”起来（handcuffed）。 由于质粒上的复制起始点被掩盖，质粒也不能进一步被复制，因此这种手铐结构能防止质粒过度复制。 在质粒需要再复制时，由3 个伴侣蛋白DnaK-DnaJ-GrpE 组成的复合物可对质粒进行“解铐”，使质粒恢复“自由身”，再由RepA 进行复制。

由WH1 功能域聚合成的结构能结合刚果红，并将其吸收峰红移至500 nm，说明WH1 形成的聚合物确实具有Prion 型的结构。

假单胞杆菌中RepA 蛋白的例子说明，有些蛋白分子可有2 种结构和2 种功能状态。在RepA分子通过WH1 功能域形成同质二聚体时，分子还是由α－螺旋组成，分解为单体后也以α－螺旋的结构执行复制质粒的工作。 WH1 功能域变为横向β-折叠后，RepA 分子也形成二聚体，但却是通过β-折叠的结构而结合，其功能不再是复制质粒，而是将2 个质粒连在一起，阻止质粒复制。 在这里，Prion 型结构的蛋白也有正常的生理功能，与引起疾病的传染性蛋白变为Prion 型结构后丧失正常的生理功能不同。当然Prion 型结构的蛋白质杀伤细胞也可以算作一种“功能”，但并非正常的生理功能。

RepA 蛋白的例子也说明，Prion 型结构的蛋白，即使在细菌的细胞内，也可以是没有毒性的。下一个例子是Prion 型结构的蛋白在哺乳动物的细胞内，不但没有毒性，还执行重要的生理功能，这就是Pmel17 蛋白在黑色素形成中的作用。

3.5 Prion 型的Pmel17 蛋白作为黑色素合成的模板 黑色素（melanin）是生物合成的色素。 生物以酪氨酸为原料，经过几个氧化步骤，再进行聚合，形成黑色素。 黑色素能吸收光线，包括可见光和紫外光。在皮肤中，位于上皮底层的黑色素细胞（melanocyte）合成黑色素，保护皮肤不受紫外线的伤害。 在眼中，黑色素由视网膜上的色素细胞（retinal pigment epithelial cells，RPE）合成，其作用是遮光，避免光线从视网膜的后面进入感光细胞。黑色素是在细胞的黑色素体（melanosome）中合成的。 黑色素体是细胞的一种细胞器，有膜包裹，膜内环境为酸性（pH 值5.0 左右）。

1930年，在小鼠身上发现了一个基因，它的突变会使小鼠合成黑色素的功能受到阻碍，小鼠身体为白色，因而被称为“银白基因”（silver gene）。 到了1991年，此基因被克隆，出人意料的是，这个基因与黑色素合成的化学反应并没有直接关系，而与黑色素体的形成有关，因为被称为“前黑色素体蛋白”（premelanosome protein 17，Pmel17）。 用电镜检查黑色素体，发现其中有定向排列的纤维，黑色素就在这些纤维上生成，组成这些纤维的是Pmel17蛋白。

Pmel17 起初是一个膜蛋白，即通过蛋白质的穿膜区段与黑色素体的膜相联系，其主要部分伸入至黑色素体腔内。 蛋白酶将Pmel17 蛋白切为2段： 仍然与膜联系的Mβ 段和在腔内的Mα 段。Mβ 段随后被降解，而Mα 段则改变肽链折叠状况，形成横向β-折叠，聚合成为纤维。这些纤维能被刚果红和硫黄素T 染色，证明它的确具有Prion型的结构。

研究发现，Pmel17 纤维能作为模板，使得形成黑色素的前体分子能在其上聚合，最后形成黑色素。没有Pmel17 蛋白，黑色素则无法形成。有趣的是，引起阿茨海默症的Aβ 蛋白和引起帕金森氏症的“α-突触核蛋白”（α-synuclein，见文章第1部分）也能促使黑色素的形成，说明是Prion 型蛋白的结构作为黑色素前体分子聚合的模板。

从本文的前2 个部分知道，Prion 型结构的蛋白，特别是在低聚状态时，可能会对细胞产生毒性。 Peml17 蛋白就是在细胞内聚合的，怎样避免其毒性？生物采取的办法一是隔离，即这个聚合过程在被膜包裹的黑色素体中发生；二是让Pmel17聚合为Prion 型蛋白的过程尽可能快速，这样低聚物就没有时间对细胞造成伤害。 在大肠杆菌内合成的Pmel17 的Mα 片段在高浓度（8 mol/L）的尿素（破坏蛋白结构的分子）溶液中能以可溶状态存在，但是一旦尿素溶液被稀释，Mα 片段在数秒时间内就聚集成纤维，比Aβ 蛋白片段聚合的速度快万倍，这就防止了低聚合度的Pmel17 纤维与细胞内容物接触的机会。

合成黑色素的中间产物在化学性质上也非常活泼，还有可能经由扩散通过黑色素体的膜进入细胞质，与其他分子发生化学反应而伤害细胞。让这个聚合过程在黑色素体内的Pmel17 纤维上发生，即可防止中间产物与细胞中的其他分子接触，不至于伤害到细胞。 因此，Pmel17 纤维作为黑色素前体分子聚合的模板，具有催化和吸附的双重意义。

3.6 Prion 型的牙釉蛋白作为牙釉形成时羟磷灰石晶体聚合的模板 牙釉（enamal）是牙齿最外面的部分，是生物材料中硬度最高的。成熟的牙釉主要由单晶体的羟磷灰石（hydroxyapatite）组成，这些晶体直径约50 nm，长数百μm，所以成纤维状。而在牙釉形成的过程中，Prion 型结构的牙釉蛋白（amelogenin）对羟磷灰石的聚合起到模板作用。

在牙釉形成的初期，成釉细胞（amelocyte）分泌多种成釉蛋白，其中主要是牙釉蛋白。牙釉蛋白由175 个氨基酸残基组成，其氨基端是亲脂的，能形成横向β-折叠的结构，而其羧基端含有若干带电的侧链，能与钙离子和磷酸根结合。在钙离子和磷酸根存在的环境中，氨基端会改变折叠状态，形成Prion 型的结构，能被刚果红和硫黄素T 染色，光学测定也证实了其纤维的横向β-折叠结构。这样形成的纤维就作为羟磷灰石晶体生长时的模板，且形成的纤维状晶体的方向也与釉质蛋白小纤维的方向一致。

在釉质形成的过程中，成釉细胞也会分泌蛋白酶Kallikrein-4（KLK4），将牙釉蛋白逐渐降解，腾出空间使更多的羟磷灰石纤维生长，因此在成熟的牙釉中，牙釉蛋白已不复存在，其作用只是在牙釉形成的初期以Prion 小纤维的形式为羟磷灰石晶体的生长提供模板。

3.7 Prion 型的结构可能作为植物中橡胶形成时的模板 橡胶是橡胶树（Hevea brasiliensis）合成的，由异戊二烯单位组成的聚合物。在合成橡胶的细胞中，异戊二烯的聚合物存在于一种球形的“橡胶颗粒”（rubber partical）中。颗粒的内部是异戊二烯的聚合物，表面是一层脂膜，脂膜内有合成橡胶的酶，异戊二烯转移酶（prenyltrnasferase），它可以催化单体的异戊二烯二磷酸 （isoprenyl pyrophosphate）中的异戊二烯部分被加到聚合物上，使聚合物的链不断伸长。 细胞质中的异戊二烯二磷酸从橡胶颗粒的表面与转移酶接触，被添加到颗粒内的聚合物上，使得颗粒不断长大。

研究发现，异戊二烯转移酶并不能单独催化此反应，而是需要膜中的另一个称为“橡胶延长因子”（rubber elongation factor，REF）的蛋白。 从橡胶颗粒上去除REF，会使异戊二烯转移酶无法将异戊二烯单位添加至聚合物上。

有趣的是，REF 能聚合，形成Prion 型的结构。光谱测定，包括圆二色性测定，表明单体的REF蛋白主要含有α-螺旋，而聚合状态的REF 含有β-折叠。 这个聚合物能被刚果红染色，X-射线衍射实验证实了横向的β-折叠结构。 由于REF 并不直接参与化学反应，REF 蛋白对橡胶合成的必要性有可能像黑色素的合成那样，以其Prion 结构作为异戊二烯形成聚合物时的模板。

（待续）