改良酶法乙醇测定试剂的研制及性能考察

王 珂

(公安海警学院，浙江宁波 315801)

0 引言

乙醇的成瘾性和滥用是当今世界范围内最严重的社会经济和公共卫生问题之一［1］，近年来，酒后引起的刑事案件和交通事故案件不断上升，2011年5月1日《中华人民共和国刑法修正案(八)》正式实施，醉酒驾驶作为危险驾驶罪被追究驾驶人刑事责任。目前，许多国家都制定了血中乙醇浓度与交通事故责任认定的关系，因此，血中乙醇检验在此类案件的审理中至关重要［2-3］。目前生物样品中乙醇定量测定的参考方法为气相色谱法，但该法仪器昂贵，手续复杂不便推广［4］，而酶法分析中乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)对乙醇是相对特异的，不会与甲醇、丙酮或异丙醇等起催化反应，因此准确度和精密度较高，并且可在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行测定，速度快，与气相色谱法相关性好［5-6］，因此应用前景较广。但由于ADH在酸性(pH低于6.0)或碱性(pH大于8.5)条件下极不稳定，并且重金属和使用的反应促进剂如氨基脲盐酸盐等对其有明显抑制作用［5-7］，因此目前该试剂多制成干粉试剂，复溶后也须尽快使用，无法满足实际检测需求。本文对酶法血乙醇检测试剂进行了改良并对相关性能进行了评价，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

维生素C为上海生工生物工程有限公司产品，批号:20101123;中/长链脂肪乳注射液(C6-C24)，批号:80DH066，为华瑞制药有限公司产品;游离胆红素及结合胆红素:购于百灵威科技有限公司，批号分别为LK50L19和JH10-4286;血红蛋白:购于上海瑞齐生物科技有限公司，批号:20101203;日立7180全自动生化分析仪(日本岛津公司);pH数字式酸度计FE20(梅特勒-托利多)。

1.2 方法

1.2.1 检测原理

样本中的乙醇在ADH催化下生成乙醛，同时将等量的氧化型辅酶Ⅰ(β-NAD)还原成还原型辅酶I(NADH)，在340 nm波长处检测吸光度变化，参照乙醇标准液吸光度变化可计算出样本中乙醇浓度。

1.2.2 试剂配制

试剂1:100 mM焦磷酸钠-甘氨酸缓冲液(pH 9.1)，10 g/L氨基脲盐酸盐，1 g/L叠氮钠;试剂2:100 mM 哌嗪-1，4-二乙磺酸(PIPES)缓冲液(pH 6.7)，30 mM β-NAD，40 KU/L ADH，1 g/L 牛血清白蛋白(BSA)，0.5 mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)，1 g/L 叠氮钠。

1.2.3 参数

终点法，检测波长为340 nm(主)，反应温度为37℃ ，样本用量2μL，试剂1用量200μL，试剂2用量50μL，样品加试剂1混匀，30～37℃孵育3～5 min后读取吸光度A0，立即加入试剂2混匀，30～37℃反应5 min后，读取吸光度A1，ΔA=A1-A0。

1.2.4 试剂成份和浓度对检测性能的影响。

参照文献［5］和［7］-［9］，考察不同种类及浓度试剂成分对试剂反应灵敏度和稳定性影响，以乙醇样本反应前后吸光度的变化率为指标。

1.2.5 对研制的乙醇试剂进行方法学评价

试剂的精密度按EP5-A2文件中的方法评价［10］:取乙醇高值与低值的混合血清各一份，测定20次，计算批内精密度。

试剂检测线性根据EP6-A文件中的方法评价［11］:取乙醇高、低值血清样本各一份。将高值和低值血清分别按不同比例混合稀释成不同浓度梯度的样本，并将这些样本随机排列进行测定，各个浓度重复测定3次，取其均值为测定值，与实际值做线性对比。

方法学对比实验按照EP9-A2文件中的方法评价［12］:选择不同浓度的乙醇样本40份，分别用本试剂及申能-德赛试剂对样本进行检测。

样本中共存的干扰成分可导致患者检测结果与真值间偏离，影响对结果的判断，因此验证和确认干扰，明确干扰物质引起的结果差异，越来越受到关注，本研究按EP7-A2文件对改良酶法乙醇测定试剂抗干扰性能进行评价［13］:将血清标本分为两份，第一份按9:1比例加入生理盐水，第二份按同样比例加入血样本中常见的干扰物溶液［5-6］，然后将第一份作为第1管，第二份作为第 5 管，将两者分别按 3∶1、2∶2、1∶3混合作为第2、3、4管，用试剂分别测定3次，计算平均值和标准差，以相对偏差≥10%作为有明显干扰的评判指标。

试剂热稳定性通过将试剂置于37℃水浴，分别于水浴前及水浴7天后测定，采用同一份高浓度乙醇样本进行检测;试剂长期稳定性通过将试剂置于2 ～8 ℃，分别于第0、1、3、6、9、12 个月进行测定，采用同一份高、低浓度乙醇样本进行检测;试剂开口稳定性实验通过将试剂定标后，开口放置于生化分析仪的试剂仓，分别在开口 1、4、7、15、21、30 天，选用高、低两种浓度的乙醇样本，比较开口前后的检测结果偏差。

2 结果

2.1 试剂配方优化试验

2.1.1 试剂R1缓冲体系及pH选择

参照文献［7］和［8］，分别制备100 mmol/L焦磷酸钠-甘氨酸缓冲液和三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)缓冲液作为试剂R1的缓冲液，pH均为9.0，试剂中其他成份相同，观察反应灵敏度，发现焦磷酸钠-甘氨酸缓冲液反应灵敏度较好，而Tris-HCl缓冲液反应速率较慢，因此选择焦磷酸钠-甘氨酸缓冲液，然后将焦磷酸钠-甘氨酸缓冲液配成pH 8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，结果发现 pH 为 9.0 灵敏度最高。因此选择pH 9.0焦磷酸钠-甘氨酸缓冲液为R1缓冲体系。

2.1.2 试剂R2缓冲体系及pH选择

由于β-NAD在酸性条件下较稳定，而ADH在中性及弱碱性条件下反应性能佳，因此我们选用近中性的缓冲液。分别制备100 mmol/L柠檬酸钠缓冲液和PIPES缓冲液作为试剂R2的缓冲液，pH均为7.0，观察灵敏度和试剂的稳定性，结果发现两者在反应灵敏度上无差异，但PIPES缓冲液配制的试剂稳定性较好，因此选择 PIPES缓冲液，然后将PIPES 缓冲液配成 pH 6.5、6.7、7.0、7.2、7.5，结果发现pH为6.7灵敏度最高。因此选择pH 6.7的PIPES缓冲液为R2缓冲体系。

2.1.3 反应促进剂的种类及其浓度的选择

参照文献［5］和［9］，我们分别加入5 g/L氨基脲盐酸盐和盐酸肼于R1试剂中作为反应的促进剂，结果发现加入氨基脲盐酸盐对反应促进作用较大，因此选择氨基脲盐酸盐作为反应促进剂，进一步我们分别加入浓度为5、10、15、20、25 g/L 的氨基脲盐酸盐，结果发现10 g/L的氨基脲盐酸盐灵敏度最高。

2.1.4 β-NAD 浓度的选择

分别 制 备 β-NAD 浓 度 为 10、20、30、40、50 mmol/L的试剂R2，结果发现随着β-NAD浓度的升高，试剂灵敏度也升高，但升至30 mmol/L以上时，灵敏度变化不大，故选用30 mmol/L的浓度。

2.1.5 EDTA-2Na 浓度的选择

分别制备 EDTA-2Na 浓度为 0.00、0.25、0.50、1.0、2.0 mmol/L 的试剂 R2，结果发现当 EDTA-2Na浓度在0.5 mmol/L以上时，试剂较稳定，故选用0.5 mmol/L的浓度。

2.1.6 乙醇脱氢酶浓度及保护剂的选择

分别制备含浓度为 10、20、30、40、50 KU/LADH的试剂R2，结果发现当其浓度在40 KU/L以上时，试剂灵敏度较好，故选用40 KU/L的浓度。参照文献［12］，选用 1 g/L BSA、半胱氨酸、谷胱甘肽为ADH保护剂，结果发现含BSA的试剂R2稳定性最好，因此选择BSA作为ADH的稳定剂。

2.2 分析特性实验和方法学评价

2.2.1 精密度

对乙醇高、低值混合样本重复测定20次，结果显示，其批内变异系数分别为 0.7%和1.6%(见表1)。

表1 批内精密度实验结果

2.2.2 线性范围

通过对不同浓度乙醇混合样本测定数据结果显示，该试剂的线性范围评估相关方程及相关系数分别为 Y=1.024 7X-0.017 1 和 R2=0.999 1(浓度范围为0 ～2.5 g/L)。

2.2.3 方法学对比实验

结果显示，本试剂(Y)与申能-德赛试剂(X)的样本测定结果比较，Y=1.022 6X-0.034 3，R2=0.998 4;

2.2.4 抗干扰性能

检测结果表明，344μmol/L结合胆红素，2.2 mM维生素C，26 mM甘油三酯，5 g/L血红蛋白，25.2 mM肌酐，134 mM葡萄糖，390 mM尿素对检测结果无干扰。

2.2.5 稳定性

将试剂放置于37℃水浴中，用水浴前及水浴7天后的试剂测定同一份高浓度乙醇混合样本，结果见表2。

表2 试剂热稳定性结果

将试剂放置于2～8℃保存，分别于第0、1、3、6、9、12个月测定同一份高、低浓度乙醇样本，结果见图1。结果显示，其检测结果偏差小，试剂稳定性较好。将试剂在检测仪器上开口不定标检测样本值，结果见图2，结果表明，其检测结果偏差小，开口稳定性较好，为临床检测的实际工作提供了方便。

图1 试剂长期稳定性结果

图2 试剂开口稳定性结果

3 讨论

血乙醇检测是法医毒化分析中的一项基本工作，在酒后驾车、中毒死亡等案件的鉴定中也至关重要［3］。本研究通过加入合适浓度的 ADH保护剂BSA及重金属螯合剂EDTA-2Na，并选择pH 6.7的PIPES作为缓冲液，使ADH在此条件下2～8℃至少可以稳定1年，并参照文献［5］和［7］在R1中添加甘氨酸来解除产物乙醛及反应促进剂氨基脲盐酸盐对ADH的抑制作用。按本研究制备的酶法乙醇试剂，测定高低值浓度样本的批内精密度CV值分别为 0.7% 和 1.6%，线性范围可达 2.5 g/L，与申能-德赛试剂比较 R2为0.998 4，344μmol/L 结合胆红素，2.2 mM 维生素 C，26 mM 甘油三酯，5 g/L血红蛋白，25.2 mM 肌酐，134 mM 葡萄糖，390 mM 尿素对检测结果均无干扰，试剂抗热能力强，2～8℃储存至少可稳定一年，可满足样本检测需求。

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