两种竹荪多糖含量测定方法的不确定度比较

陶秋云，何明先，张 鹏，邓清月 ，郭 松

（1.金秀瑶族自治县国有金秀林场，广西 来宾 545799；2.广西科技师范学院食品与生化工程学院，广西 来宾 546199；3.广西科技师范学院壮瑶药品质生物学重点实验室，广西 来宾 546199）

竹荪（Dictyophora indusiata）为鬼笔科竹荪属真菌，又称竹姑娘、仙人竹等.竹荪是一种名贵的药食两用真菌，生于枯枝落叶和腐殖质多的竹林或阔叶林中，主要分布在四川、云南、福建、台湾和湖南等地，素有“真菌皇后”之称［1-2］.竹荪有着优质的蛋白质和丰富的营养物质，食用后可以起到降血压、降血脂［3］、抗氧化、补气养阴［4］、抗炎［5］、免疫调节［6］等活性和药理作用.目前，定量测定竹荪多糖含量常见的方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和高锰酸钾滴定法［7］等.由于这几种方法灵敏度各不相同，所以在一定浓度范围内检测结果的准确度也不同，而且在分析过程中都不可避免地存在误差，此时不确定度的大小就发挥了重要作用.

测量不确定度是评定测量结果质量好坏的重要指标，是现代误差理论的重要内容之一.不确定度是用于确定检测结果可信程度的重要指标，与测量结果有关，并用来合理表征被测值离散度的重要参数［8-9］.如今，不确定度的测量越来越受到重视，在各行各业检测过程中的应用日益广泛.目前，关于竹荪的研究主要集中于苯酚-硫酸法［7，10］测定竹荪多糖含量，而采用蒽酮-硫酸法测定竹荪多糖含量的研究相对较少［11-12］.

本研究以竹荪多糖提取物为研究对象，采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法两种方法，利用紫外可见分光光度计分别测定竹荪多糖，根据JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》［13］对试验过程中可能引入不确定度的各种因素进行了分析，计算合成不确定度和扩展不确定度，旨在为确定合理的竹荪多糖含量测定方法提供依据，并在实验室试验过程中确保检测数据的准确性和可靠程度提供参考价值.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

无水葡萄糖（分析纯，产地为西陇科学股份有限公司）；竹荪多糖提取物（西安宝益丰生物科技有限公司，多糖含量为70%）；苯酚（分析纯，武汉长成化成科技发展有限公司）；硫酸（分析纯，廉江市爱廉化试剂有限公司）；蒽酮（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）.

FA2004 电子分析天平（上海舜宇恒平科技仪器有限公司）；HH-S4 数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；UV-5100 紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）.

1.2 实验方法

参照NY/T 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的测定》［14］，稍作修改.准确称取10 mg 105℃干燥的葡萄糖标准品置于100 mL 容量瓶中，加适量蒸馏水溶解并定容至刻度，制备成0.1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液，摇匀备用.

1.2.1 苯酚-硫酸法标准曲线的绘制

准确称取5 g 苯酚置于100 mL 棕色容量瓶中，加适量的蒸馏水溶解并定容至刻度线，摇匀备用.精密移取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL 的0.1 mg/mL 葡萄糖标准品溶液于编号为1 至7 的7 支10 mL 比色管中，分别加蒸馏水补足至2.00 mL 后，依次加入5%的苯酚溶液1.00 mL、浓硫酸5.00 mL，充分摇匀后室温静置6 min，然后放入水浴中反应15 min.将1 至7 号管溶液依次置于紫外可见分光光度计中在波长490 nm 处测定吸光度A，将其为纵坐标，以葡萄糖标准溶液浓度C（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线.

1.2.2 蒽酮-硫酸法标准曲线的绘制

参照张妍、刘太林和林艺华的研究方法［11-12］，稍作修改.准确称取0.20 g 蒽酮置于100 mL 棕色容量瓶中，加适量硫酸溶液溶解并定容至刻度，混匀即可.

精密移取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL 的0.1 mg/mL葡萄糖标准品溶液于编号为1 至7 的7 支10 mL 比色管中，分别加蒸馏水补足至2.00 mL后，依次加入蒽酮-硫酸溶液6.00 mL，充分摇匀后室温静置6 min，然后放入水浴中反应15 min.将1 至7 号管溶液依次置于紫外可见分光光度计中在波长620 nm 处测定吸光度A，将其为纵坐标，以葡萄糖标准溶液浓度C（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线.

1.3 不确定度来源分析

1.3.1 A 类不确定度

测量竹荪多糖提取物的重复性试验.样品重复性试验中对测定值引入的不确定度，可采用统计分析法进行评定.

1.3.2 B 类不确定度

不确定度的B类评定由以下方面引入：标准物质纯度、电子天平称量、容量瓶允许误差、移液器允许误差、比色管允许误差、实验室温度和紫外可见分光光度计以及标准曲线拟合引入的不确定度.

1.4 数据处理

通过Microsoft Office Excel 2010 软件完成数据的整理与统计；并使用软件Origin2018 绘制图像.

2 结果与分析

2.1 数学模型的建立

参照张妍［10］、钟岩［12］等人的方法，稍作修改.准确称取竹荪多糖提取物10 mg，置于100 mL 容量瓶中，加适量蒸馏水水溶解并稀释至刻度，摇匀可得0.1 mg/mL 的竹荪提取液；精密吸取0.6 mL，补加蒸馏水至2.0 mL，按“1.2.1”项、“1.2.2”项方法显色、测定吸光度值.按下式计算：

式中：ω——样品中竹荪多糖含量，%；

D——比色管中竹荪多糖提取物溶液的稀释倍数；

C——从标准曲线上查得样品测定液中含糖量，单位为μg/mL；

V——所取竹荪多糖提取物定容的体积，单位为mL；

M——竹荪多糖提取物的质量，单位为mg；

计算结果保留小数点后两位.

2.2 测量不确定度的评定

整个测量过程中对测量结果引入的不确定度来源如图1 所示.

图1 测量不确定度来源因果图Figure 1 Cause and effect diagram of uncertainty measurement source

结合化学分析JJF1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》，并从实验的测定方法与步骤中分析，两种竹荪多糖含量测定方法的不确定度来源主要包括：①标准物质及配制过程中引入的不确定度；②样品处理引入的不确定度；③紫外可见分光光度计引入的不确定度；④标准曲线拟合引入的不确定度；⑤样品重复性引入的不确定度.

2.2.1 标准物质及配制过程中的不确定度

2.2.1.1 葡萄糖标准物质纯度引入的不确定度

从该标准品证书中查得葡萄糖标准品的纯度（99.6±0.5）%，为均匀分布，其k为计算，由标准品纯度引入的标准不确定度为；其相对标准不确定度为

2.2.1.2 称量标准物质引入的不确定度

根据标准，使用FA2004电子天平称取0.1g葡萄糖标准物质于100mL容量瓶中，由检定证书得到电子天平的最大允差是±0.1mg，取均匀分布计算，则电子天平引入的标准不确定度为：；其相对标准不确定度为

2.2.1.3 标准物质测定中，容量瓶引入的不确定度

实验使用的容量瓶体积为100 mL（A等品），依据JJG 196-2006《常用玻璃容器检定规程》中查得允差为±0.1 mL，取均匀分布计算，则该容量瓶引入的不确定度为；20℃时水的体积膨胀系数为2.1×10-4，在实验室中环境温度变动为±5℃，取均匀分布计算，其不确定度为因此由体积100 mL容量瓶引入的标准不确定，其相对标准不确定度为

2.2.1.4 标准物质测定中，移液器引入的不确定度

采用差量法使用1 000 μL 移液器分别移取200 μL、400 μL、600 μL、800 μL、1 000 μL葡萄糖标准溶液，参照JJG 646-2006《移液器检定规程》，1 000 μL 移液器的最大允差为±1.0% mL，取均匀分布计算，1 000 μL 移液器引入的不确定度为；20℃时水的体积膨胀系数为2.1×10-4，在实验室中环境温度变动为±5℃，取均匀分布计算，其不确定度为故1 000 μL 移液器引入的标准不确定度为，其相对标准不确定度为

2.2.1.5 标准物质不确定度合成

合成以上标准物质和溶液配制过程中可能影响竹荪多糖含量的相对标准不确定度，如下式所示：

2.2.2 样品处理引入的不确定度

2.2.2.1 样品称量引入的不确定度

由检定证书得到FA2004 电子天平的最大允差为±0.1 mg，取均匀分布计算，则电子天平引入的标准不确定度为；其相对标准不确定度为

2.2.2.2 样品测定中，容量瓶引入的不确定度

实验使用的容量瓶体积为100 mL（A等品），依据JJG 196-2006《常用玻璃容器检定规程》中查得允差为±0.1 mL，取均匀分布计算，则该容量瓶引入的不确定度为；20℃时水的体积膨胀系数为2.1×10-4，在实验室中环境温度变动为±5℃，取均匀分布计算，其不确定度为故100 mL 容量瓶引入的标准不确定度为，其相对标准不确定度为

2.2.2.3 样品测定中，移液器引入的不确定度

2.2.2.4 样品测定中，比色管体积引入的不确定度

2.2.2.5 样品不确定度合成

综上所述，样品处理引入的不确定度合成如下式：

2.2.3 紫外可见分光光度计引入的不确定度

2.2.3.1 苯酚-硫酸法使用紫外可见分光光度计引入的不确定度

由5100 系列紫外可见分光光度计用户手册可知，该仪器的光度准确度为±0.5%，取均匀分布计算，其标准不确定度为，葡萄糖标准溶液吸光度平均值A0为0.290，竹荪提取液吸光度平均值AX为0.196，其相对标准不确定度分别为

2.2.3.2 蒽酮-硫酸法使用紫外可见分光光度计引入的不确定度

由5100 系列紫外可见分光光度计用户手册可知，该仪器的光度准确度为±0.5%，取均匀分布计算，其标准不确定度为，葡萄糖标准溶液吸光度平均值A01为0.326，竹荪提取液吸光度平均值AX1为0.210，其相对标准不确定度分别为

2.2.4 标准曲线拟合引入的不确定度

2.2.4.1 苯酚-硫酸法制作标准曲线引入的不确定度

配制7 种不同浓度的葡萄糖标准溶液，依据苯酚-硫酸法操作，每种浓度分别在紫外可见分光光度计上测定，其浓度与吸光度值的关系如表1 所示，根据测量数据用最小二乘法拟合，得出回归方程A1=aCi+b，斜率a=0.038 79，截距b=-0.001，R2=0.9994，利用标准曲线求得吸光度的理论值aCi+b，计算Ai和的差值，根据贝塞尔公式计算标准偏差为：

根据表1 计算可得，式中S为残差标准偏差；p=7（竹荪提取液的测定次数）；n=7（葡萄糖标准溶液的测定次数）；Ai为第i次测定葡萄糖标准溶液的吸光度值为利用标准曲线求得理论吸光度值；CX为竹荪提取液的平均浓度（CX=5.10 μg/mL）；Ci为第i次测定葡萄糖标准溶液的浓度为葡萄糖标准溶液的平均浓度.

表1 葡萄糖标准溶液浓度与吸光度值在标准曲线中计算结果表Table 1 Calculation results of glucose standard solution potency and absorbance value in standard curve

2.2.4.2 蒽酮-硫酸法制作标准曲线引入的不确定度

配制7 种不同浓度的葡萄糖标准溶液，依据蒽酮-硫酸法操作，每种浓度分别在紫外可见分光光度计上测定，其浓度与吸光度值的关系如表2 所示.根据测量数据用最小二乘法拟合，得出回归方程A2=aCj+b，斜率a=0.047 71，截距b=0.001，R2=0.9992，利用标准曲线求得吸光度的理论值aCj+b，计算Aj和的差值，根据贝塞尔公式计算标准偏差为：

表2 葡萄糖标准溶液浓度与吸光度值在标准曲线中计算结果表Table 2 Calculation results of glucose standard solution potency and absorbance value in standard curve

式中S0为残差标准偏差；p=7（竹荪提取液的测定次数）；n=7（葡萄糖标准溶液的测定次数）；Aj为第j次测定葡萄糖标准溶液的吸光度值为利用标准曲线求得理论吸光度值；CY为竹荪提取液的平均浓度（CY=4.38 μg/mL）；Cj为第j次测定葡萄糖标准溶液的浓度为葡萄糖标准溶液的平均浓度.

2.2.5 样品重复性引入的不确定度

2.2.5.1 苯酚-硫酸法的样品重复性引入的不确定度

竹荪多糖含量的重复性测量结果见表3，由贝塞尔公式求得标准偏差（n=7）：

表3 两种方法测定竹荪多糖含量重复性测量结果表Table 3 Repeatability measurement results of Dictyophora Indusiata’s Polysaccharide by two methods

2.2.5.2 蒽酮-硫酸法的样品重复性引入的不确定度

竹荪多糖含量的重复性测量结果见表3，由贝塞尔公式求得标准偏差（n=7）：

2.2.6 合成不确定度

2.2.6.1 苯酚-硫酸法合成不确定度

表4 不确定度有关参量及贡献率Table 4 Uncertainty-related parameters and contribution rate

2.2.6.2 蒽酮-硫酸法合成不确定度

表5 不确定度有关参量及贡献率Table 5 Uncertainty-related parameters and contribution rate

依据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》的规定，取包含因子k=2，相对扩展不确定度为，所以，竹荪多糖含量可表示为（58.35±4.10）%.

综上所述，通过苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法测定竹荪多糖含量的不确定度评定，可以得出紫外可见分光光度计和标准曲线拟合对测量结果的不确定度影响较大，标准物质及配制过程、样品处理和样品重复性测定次之.

3 结论与结论

我们以竹荪多糖提取物为研究对象，采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法两种方法，利用紫外可见分光光度计测定竹荪多糖的含量，通过两种方法对竹荪多糖含量的不确定度评定，根据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》对各因素的不确定度进行计算和合成，得出：苯酚-硫酸法测定竹荪多糖的测定结果为（67.99±3.72）%，扩展不确定度为3.72%（k=2）；蒽酮-硫酸法测定竹荪多糖的测定结果为（58.35±4.10）%，扩展不确定度为4.10%（k=2），根据计算所得各个分量的不确定度可知紫外可见分光光度计和标准曲线拟合引入的不确定度影响较大，标准物质及配制过程、样品处理和样品重复性次之.结果表明蒽酮-硫酸法测得的扩展不确定度大于苯酚-硫酸法的扩展不确定度，因此苯酚-硫酸法是测定竹荪多糖较为理想的方法.

实验过程中我们要严格按照实验操作的要求，控制葡萄糖标准曲线的绘制及拟合，并选用灵敏度高的紫外可见分光光度计，严格其进行校准和检定，以减少其引入的不确定度，可提高检测质量和检测结果的准确性.本研究为确定合理的竹荪多糖含量测定方法和评定测定结果的质量提供了科学依据，并为竹荪及其产品的开发利用提供了数据支持.