毛竹快速生长期茎秆不同节间碳水化合物代谢的变化

翟建云，孙建飞，马元丹，卜柯丽，王柯杨，温国胜，高海波，高 岩，张汝民

(1.浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 杭州 311300； 2.临沂大学 生命科学学院，山东 临沂 276000)

碳水化合物是一类广泛存在于自然界中的重要能量来源，参与植物细胞的组成和多种生命活动，为植物的生长发育提供能量、结构物质和信号物质，在植物体内的存在形式主要有2种：非结构性碳水化合物主要参与植物的生命代谢；结构性碳水化合物主要用于植物的形态建成[1-3]。刘洋等[4]研究甜高粱(Sorghumbicolor)茎秆糖分代谢发现，随节间升高葡萄糖和果糖呈“高—低—高”的变化趋势，蔗糖无显著变化规律。研究发现在拟南芥(Arabidopsisthaliana)下胚轴中，蔗糖诱导植物生长素的运输和信号转导，从而促进拟南芥的生长[5]。Magel等[6]研究竹类Sasapalmata生长中茎秆可溶性碳水化合物和酸性转化酶(acid invertase, AI)发现，己糖质量分数与细胞伸长和膨胀有关，与细胞壁结合的AI活性高可促进茎秆生长。研究不同生长阶段甘蔗(Saccharumofficinarum)蔗糖积累发现，甘蔗组织中糖的合成与分解是由蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)、中性转化酶(neutral invertase, NI)和AI进行协调的[7]。Huber等[8]研究结果发现SPS活性与蔗糖质量分数之间存在正比关系，与淀粉合成之间存在呈负相关，表明SPS能够对蔗糖和淀粉之间碳的分配产生影响。研究栽种期至展叶期兰州百合(Liliumdavidiivar.willmottiae)和亚洲百合(LiliumAsiatic hybrids)鳞茎发现，发育过程中淀粉的积累与淀粉磷酸化酶(starch phosphorylase, SP)存在正比关系，说明鳞茎淀粉的合成和SP相关[9]。毛竹(Phyllostachysedulis)是隶属禾本科的竹类植物，是浙江及其周边地区重要的竹种，具有良好的经济、生态和社会效益[10]。毛竹生长快速，只需2个月左右即可完成秆形生长，碳水化合物能为其茎秆快速生长提供能量和结构材料，对毛竹快速生长的研究主要涉及组织结构、光合作用、内源激素和分子生物等方面[11-14]，但对毛竹茎秆中碳水化合物代谢研究较少[15]。因此，本研究以毛竹快速生长期的茎秆为材料，研究了毛竹茎秆不同节间碳水化合物质量分数及相关代谢酶活性的变化，为进一步研究毛竹快速生长提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样地概况

试验材料采自浙江省杭州市临安区的现代毛竹示范基地(29°56′～30°27′N，118°51′～119°52′E)。该地属于亚热带季风气候，雨水充沛，年平均气温为16.4 ℃，1月平均气温为3.4 ℃，7月平均气温为28.1 ℃。年降水量为1 628.6 mm，年日照时数为1 847.3 h。森林覆盖率为76.5%，采样地土质为红壤。

1.2 试验设计

在2016年4月至5月毛竹快速生长阶段，于上午10:00选取生境条件一致、生长状况良好和高度(3±0.2)m的毛竹笋竹。从靠近地面的基部伐倒，挖出竹篼，并对竹篼中间部位进行取样，地上部分由茎秆基部起每间隔2节依次取样。将所取竹篼编号为0，地上部分节间按基部到顶部依次编号为1、4、7、10、13、16、19、22。取样后立即置于液氮中冷冻，并置于-80 ℃超低温冰箱内保存。选取5株笋竹，1株为1个处理，5次重复。

1.3 测定方法

1.3.1可溶性糖测定 称取0.5 g植物样品，研磨至匀浆，加蒸馏水9 mL，沸水浴提取10 min，不断搅拌。冷却，离心(3000 r·min-1, 5 min)，取上清液。蔗糖、果糖和葡萄糖分别采用果糖和蔗糖试剂盒(南京建成科技有限公司生产)、葡萄糖试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司)测定，具体方法按说明书操作。

1.3.2淀粉测定 将上述可溶性糖提取后的沉淀用体积分数为80%乙醇冲洗1遍，加蒸馏水3 mL，搅拌均匀，沸水15 min。冷却后，加入冷的高氯酸(9.2 mmol·L-1) 4 mL，搅拌提取20 min，蒸馏水定容至25 mL，混匀，离心(3 000 r·min-1, 10 min)。取上清液，采用蒽酮硫酸法测定。

图1 毛竹不同节间碳水化合物质量分数Fig.1 The carbohydrate content in different internodes of Ph. edulis

1.3.3纤维素测定 将淀粉提取后的沉淀用蒸馏水冲洗2遍，加入体积分数为60%硫酸2 mL，冰浴提取30 min，定容至25 mL，3 000 r·min-1离心10 min。取上清液，参照Chen等[16]的方法测定。

1.3.4酶活性测定 称取植物样品0.5 g，冰浴研磨，用Tris-HCl(50 mmol·L-1, pH 7.0)提取液提取定容至5 mL，10 000 r·min-1离心 10 min(4 ℃)，上清液为酶提取液。SPS、蔗糖合成酶(sucrose synyhase, SS)和转化酶(invertase, Inv)活性测定参照King等[17]的方法；SP和支链淀粉酶(pullulanase, PUL)活性测定参照Zeeman等[18]的方法。蛋白质测定参照Bradford的方法[19]。

1.4 数据分析

所有数据均取5次重复的平均值±标准误差。利用Origin 9.0软件(OriginLab公司, 美国)进行统计分析和作图，采用One-Way ANOVA对茎秆各个节间碳水化合物质量分数及相关代谢酶活性分别进行检验，并用SPSS软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 可溶性糖质量分数的变化

毛竹茎秆各个节间内可溶性糖变化结果见图1a。竹篼(0)中蔗糖质量分数最高，下部第1节间蔗糖比竹篼低了32.8%(P<0.01)；随着节间的升高，蔗糖质量分数下降显著，第7节间比第1节间降低了35.9%(P<0.01)，第7节间至顶部呈略有波动地下降。葡萄糖质量分数在竹篼中最高，基部至顶部总体呈下降趋势，第16节间至顶部变化略有波动。茎秆下部第1节间内果糖质量分数最高，比竹篼高了54.1%(P<0.01)，随节间的升高，质量分数显著下降，第10节间比第1节间低了41.5%(P<0.01)，而第10节间到顶部差异不显著。

图2 毛竹不同节间碳水化合物代谢酶活性Fig.2 Activities of carbohydrate metabolizing enzymes in different internodes of Ph. edulis

2.2 淀粉和纤维素质量分数变化

毛竹茎秆不同节间内淀粉和纤维素变化结果见图1b。茎秆第1节间淀粉质量分数最低，比竹篼低了30.3%(P<0.01)。随着节间的升高，淀粉质量分数总体呈上升趋势，基部至第10节间差异不显著，第10节间至顶部则显著上升，第22节间比第10节间高出71.3%(P<0.01)。毛竹茎秆下部第1节间内纤维素最高，是竹篼的1.9倍(P<0.01)；基部到顶部纤维素不同程度地降低，基部至第10节间下降显著，第10节间比第1节间低了51.6%(P<0.01)，而第10节间至茎秆顶部变化较小。

2.3 蔗糖代谢酶活性的变化

毛竹茎秆不同节间内SS、SPS和Inv酶活性变化见图2a。SS和SPS酶活性在竹篼中最高，分别是下部第1节间的1.6、1.7倍(P<0.01)。随着节间的升高，SS酶活性显著下降，第7节间比第1节间低了56.9%(P<0.01)，而第7节间至顶部略有波动地下降。从茎秆基部至顶部，SPS酶活性下降显著，第13节间比第1节间低了87.8%(P<0.01)，第13节间至顶部酶活性逐渐趋于0。毛竹茎秆中，Inv酶活性随着节间的升高呈现上升趋势，第4节间酶活性达到最高，之后酶活性总体呈下降趋势。

2.4 淀粉代谢酶活性的变化

毛竹茎秆不同节间内PUL和SP酶活性变化见图2-B，茎秆内PUL和SP酶活性整体较低，竹篼内PUL和SP酶活性最高。下部第1节间PUL酶活性比竹篼低了52.4%(P<0.01)，从茎秆基部到顶部，酶活性显著降低，第10节间比第1节间下降了85.3%(P<0.01)，而第10节间至顶部酶活性逐渐趋于0。毛竹茎秆中，竹篼中SP的酶活性比第1节间高出2.3倍(P<0.01)，随节间的升高活性逐渐上升，第4节间活性比第1节间高出45.5%(P<0.01)，之后活性呈总体下降，其中第13节间至顶部活性趋于0。

2.5 相关性分析

2.5.1碳水化合物相关性分析 表1毛竹茎秆内蔗糖与葡萄糖之间存在极显著正相关(P<0.01)，与其他碳水化合物之间相关性均未达到显著；果糖与葡萄糖呈显著正相关(P<0.05)，与纤维素存在极显著正相关(P<0.01)；葡萄糖与纤维素之间存在显著正相关(P<0.05)；淀粉与果糖、葡萄糖之间均存在显著负相关(P<0.05)，与纤维素质量分数之间负相关达到极显著(P<0.01)。

表1 毛竹节间碳水化合物质量分数的相关性

说明：*表示在0.05水平(双侧)上显著相关；**表示在0.01水平(双侧)上显著相关

2.5.2碳水化合物质量分数与酶活性相关性分析 表2毛竹不同节间碳水化合物质量分数与酶活性的相关性分析显示：毛竹茎秆内蔗糖、葡萄糖质量分数与SS、SPS酶活性均呈极显著正相关(P<0.01)，与Inv酶活性的相关性均不显著；果糖与Inv呈显著正相关(P<0.05)，与SS、SPS呈正相关但未达到显著。毛竹笋竹茎秆内淀粉质量分数与PUL、SP酶活性的变化均呈负相关，但未达到显著。

表2 毛竹节间碳水化合物质量分数与酶活性的相关性

说明：*表示在0.05水平(双侧)上显著相关；**表示在0.01水平(双侧)上显著相关

3 讨论

碳水化合物是植物体内能量代谢和物质代谢的基础，主要参与植物生长发育过程中碳素积累、能量供给等生理生化过程[20]。蔗糖是运输碳水化合物的主要形式之一，能引起细胞分化和成熟，己糖能促使细胞分裂和伸长；淀粉是主要的储存形式，以满足植物未来的生长需求[21-22]。Sarah等[23]对生长期甘蔗茎秆研究发现，蔗糖和总糖质量分数随茎秆节间的升高呈降低趋势。研究生长期郁金香(Tulipagesneriana)匍匐茎碳水化合物的动态变化，发现在匍匐茎发育过程中可溶性糖呈下降趋势，淀粉呈上升趋势[24]。卞云龙等[25]对不同品种玉米(Zeamays)茎秆糖分布的研究发现，糖质量分数从茎秆基部到顶部呈现增加趋势。本研究结果表明，竹篼内可溶性糖质量分数高于茎秆，可能是由于笋竹快速生长时期光合能力较弱，其生长发育所需的大部分养分原料来自周围的成竹，成竹通过地下茎将可溶性糖转运到笋竹的竹篼中，在竹篼内暂贮和周转，以满足毛竹快速生长阶段高生长和生理代谢的需求[26-27]。随着节间的升高，蔗糖、葡萄糖和果糖整体呈下降趋势，其中蔗糖质量分数的变化范围与程路芸等[15]的研究结果不同，可能是因为采样时间和所采毛竹的高度不一致，测出的质量分数不同；上午10:00左右，毛竹的整体生长速度慢于夜间，成竹转运到竹篼中的可溶性糖以蔗糖的形式运输到茎秆，由基部往上运输，基部蔗糖积累较多；中下部生长快速的节间需要消耗能量，可溶性糖水平相对较高。随着节间的升高，淀粉呈逐渐上升趋势，与程路芸等[15]研究发现淀粉质量分数下降的趋势不同。这可能是由于毛竹快速生长过程中各节间生长开始和停止的时间不同，生长速度也不一致，对淀粉的需求程度不同；中下部茎秆生长较快，淀粉大量降解为可溶性糖主要用于茎秆细胞的快速分裂和伸长；上部生长缓慢，淀粉利用相对较少，蔗糖降解的单糖即可满足基本的生理代谢活动，且本实验中节间取样取至茎秆顶部，而程路芸等[15]上部节间只取了中间一节，并未表明靠近顶部的节间内淀粉质量分数。

纤维素是毛竹细胞壁的重要结构成分，在毛竹快速生长阶段，纤维素合成是毛竹结构和形态建成必须的过程。刘波研究发现，0.68 m毛竹中部的纤维细胞进行初生壁纤维素沉积，6.90 m毛竹中部进行次生壁第1层的纤维素累积[28]。对苦竹的研究表明，1年生苦竹的茎秆上部纤维素与中部和基部相比显著降低[29]。本研究表明，茎秆基部到第10节间纤维素显著下降，之后差异不显著，说明毛竹茎秆发育、成熟是从基部到顶部顺次完成的，靠近基部的节间发育更为成熟，纤维素沉积较多[30]。实验结果分析发现，纤维素与淀粉质量分数之间呈显著负相关，与葡萄糖和果糖质量分数之间呈显著正相关，表明中下部茎秆内淀粉分解为单糖，靠近基部的几个节间发育较为成熟，主要为次生壁纤维素的形成提供底物；中部主要进行节间的快速伸长，纤维素形成较少；上部发育较晚，主要进行初生生长，纤维素质量分数低且差异较小[28]。

在整个碳水化合物合成和分解过程中，同时需要多种酶的参与[31]。植物体内，蔗糖的合成与降解包括多个酶促反应，涉及到多种酶，其中主要关键酶为Inv、SS和SPS。蔗糖可被Inv催化降解为己糖，或被SS催化分解为果糖与UDPG，为植物生长提供能量，为淀粉和纤维素提供合成底物；而己糖也可在SS或SPS的催化作用下合成为蔗糖。Krishnan等[32]研究表明高的Inv酶活性有利于将果实中的蔗糖分解成己糖，为合成纤维素、淀粉等物质提供原料和能量。在本研究中，毛竹茎秆内Inv酶活性较高，且第4节间到第7节间酶活性相对更高，说明这几个茎秆节间处于显著伸长期，需要消耗大量的能量，部分蔗糖在运输过程中被降解为己糖，为节间细胞分裂和伸长、呼吸消耗等生理代谢活动提供能量。研究结果分析表明，Inv活性与蔗糖质量分数之间存在不显著负相关，与果糖质量分数之间呈显著正相关，说明在蔗糖代谢中Inv起到一定的分解作用，但不是主要的调控酶。Verma等[33]对甘蔗茎秆内蔗糖积累研究发现，蔗糖质量分数与SPS活性之间存在相关关系，与SS活性之间呈负相关，成熟节间SPS活性高于未成熟节间，SS活性则相反。本研究结果表明，SPS和SS活性随着节间的升高而下降，与蔗糖下降趋势相同，其中SS酶活的变化与Verma等[33]的结论不同，可能是因为在毛竹茎秆中SS主要作用于蔗糖的合成，与SPS共同催化蔗糖的合成。基部节间SS和SPS酶活性较高，表明基部发育较成熟，淀粉和蔗糖降解的己糖在SPS和SS作用下重新合成蔗糖，往茎秆中上部运输；其中较高的SS活性既可以降解蔗糖为纤维素合成提供UDPG，也可以合成蔗糖，茎秆下部发育较为成熟，其合成速率高于降解速率，与SPS一同将单糖合成蔗糖运输到中上部[4,34]。相关分析发现，SPS和SS活性与蔗糖质量分数之间分别存在极显著正比关系，说明毛竹茎秆内SPS和SS在蔗糖代谢过程中可能起着主要的调节作用。

PUL和SP属于淀粉代谢酶，PUL能够专一性水解支链淀粉；SP对淀粉的催化作用是可逆的，既可以合成淀粉，也可以降解淀粉[35-36]。本实验中，SP酶活性变化趋势与淀粉质量分数变化趋势不同，和孙红梅等[9]发现百合鳞茎发育阶段SP酶活性与淀粉质量分数均下降不一致，说明毛竹快速生长时期SP与淀粉降解有关。本研究结果还发现：PUL和SP酶活性相对较低，随节间的升高均呈总体下降趋势，与淀粉呈上升趋势相反，说明中下部生长快速，淀粉可能进行了降解；而SP酶活性在第4节间到第10节间相对较高，表明这几个节间茎秆生长相对较快，需要消耗的可溶性糖多，淀粉降解较多；上部酶活性趋于0，说明上部节间生长缓慢，可溶性糖需求较低，淀粉降解较少。相关性分析表明，PUL和SP酶活性和果糖、葡萄糖质量分数均呈正相关，说明茎秆内一部分单糖来源于淀粉降解，PUL和SP催化淀粉分解为己糖，为纤维素沉积提供底物，以及茎秆细胞的快速分裂和伸长提供能量；而PUL和SP活性与淀粉质量分数之间存在不显著负相关，表明PUL和SP对淀粉的分解可能不起主要作用。

综上所述，毛竹茎秆内碳水化合物质量分数随节间升高呈有规律性变化，表明茎秆的发育成熟是从基部到顶部顺次完成的。基部节间发育较为成熟，纤维素沉积较多；中下部生长快速的节间，需求能量较多，可溶性糖相对较高；笋竹上部由于发育较晚，节间伸长较慢，对可溶性糖的需求量较低，淀粉利用相对较少。竹篼在碳水化合物的运输中起着暂时储藏和周转作用，为毛竹的快速生长提供所需的能量和结构原料。相关性分析表明，SS和SPS可能是碳水化合物代谢的主要调控酶。