青海省同德牦牛群体的父系遗传多样性及遗传背景探析

李广祯，马志杰*，陈生梅，林 元，李瑞哲，刘书杰，杨国太，周桑加

(1 青海省高原家畜遗传资源保护与创新利用重点实验室，青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016；2 青海省同德县农牧和水利局，青海 同德 813200)

前言

牦牛(Bosgrunniens)能在空气稀薄、高紫外线、寒冷和牧草生长期短的高寒生态环境中生活自如，是青藏高原及其毗邻的高山、亚高山地区的标志性畜种，可为当地藏、蒙、回等民族及其他游牧民族提供肉、奶、毛、绒、皮、交通和燃料等生产、生活必需品，是青藏高原民族文化重要的组成部分[1]。Y染色体具有遵循父系遗传、突变率低、不易受重组影响等特点，是开展哺乳动物父系遗传多样性、种群历史动态、起源和进化等研究强有力的工具[2]。近年来，Y染色体单核苷酸多态性(Y-SNP)和Y染色体微卫星(Y-STR)标记作为2种主要的Y染色体分子标记，已被用于牦牛的父系起源、遗传多样性和系统发育关系等研究[3-7]。Li等[3]最早通过对高原、环湖和天祝白牦牛共65头公牦牛的16个Y染色体基因片段进行测序分析，发现5个Y染色体基因片段(即SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY2和OFD1Y10)中6个Y-SNPs可用于牦牛父系遗传分析，共确定了3种单倍型，初步推断牦牛拥有2个高度分化的父系支系。Ma等[4]基于Li等[3]报道的5个牦牛Y-SNPs标记，对青海省9个牦牛品种(群体)进行系统的父系遗传多样性、群体遗传结构及遗传背景分析，表明青海牦牛具有较丰富的父系遗传多样性，由2大父系支系组成，发现大通牦牛品种和曲麻莱牦牛(即玉树牦牛)群体均拥有特殊的单倍型。随后，为系统探究中国牦牛的父系遗传多样性、谱系地理结构、分化、聚类关系、分子变异及系统发育关系，马志杰等[5-7]基于上述5个Y-SNPs标记和1个Y-STR INRA189标记的联合对家牦牛11个地方品种(即九龙、麦洼、娘亚、斯布、帕里、高原、环湖、甘南、巴州、中甸和天祝牦牛)、1个培育品种(即大通牦牛)和3个群体(即塔县、雪多和类乌齐牦牛)共682头公牦牛和8头野牦牛公牛进行父系遗传综合分析，表明我国牦牛拥有丰富的父系遗传多样性，遗传分化程度较高，品种(群体)间无明显的谱系地理结构，更多的遗传变异存在于品种(群体)内和品种(群体)间，由2个父系支系组成(即有2个父系起源)，16个牦牛品种(群体)可明显的分为5类，推测青海省可能是牦牛的起源与驯化地。上述研究为深入了解牦牛的父系遗传多样性水平、群体结构组成、分化程度、起源、分类和系统发育关系提供了基础数据，对进一步开展牦牛种质资源的发掘、合理保护和利用提供了重要信息。

同德县地处青海省海南、黄南和果洛3个藏族自治州的交接处，是一个以牧为主，农牧结合的少数民族地区，县内平均海拔3 660 m。畜牧业是该县的主要产业之一，牦牛是其优势畜种和宝贵的动物遗传资源，存栏量达15.6万头[8]。在先前同德牦牛的母系遗传研究中，李广祯等[9]对60头同德牦牛mtDNA D-loop区序列进行了测定分析，表明同德牦牛与其他牦牛品种(群体)相比，具有较丰富的母系遗传多样性且拥有2个母系支系。然而，当前尚未见对同德牦牛父系遗传分析的研究报道。鉴于此，本研究对同德牦牛的父系遗传多样性、群体遗传结构及父系起源进行探究，以明确其父系遗传多样性水平、群体结构组成及父系遗传背景，为后续开展同德牦牛遗传资源的合理保护与开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集与基因组DNA提取

采用颈静脉采血法在青海省同德县秀麻乡和河北乡共采集32头公牦牛的颈静脉血样，使用血液基因组DNA提取试剂盒(艾德莱生物科技有限公司，北京)提取基因组DNA，-20℃冷冻保存备用。血样采集前，仔细询问牧户并查询相应的牦牛系谱记录，采用分户随机采样方式开展采样，确保个体间无亲缘关系。

1.2 引物合成、PCR扩增与测序分型

参照马志杰[5]报道的牦牛Y-SNPs标记(即SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY3 和OFD1Y10)和Y-STR标记(INRA189)序列合成6对引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反应体系(25 μL)为：2×Prime STAR Max Premix (上海宝生物公司) 10.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，基因组DNA 1.0 μL，超纯水12.5 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性4 min；98 ℃变性10 s，Ta ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；后冷却至4 ℃保存。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶(含Gold View 核酸染料)电泳、凝胶成像系统拍照检测后，将目的条带单一、扩增效率高的PCR产物回收纯化，送至北京擎科生物有限公司进行正、反向测序。同时，Y-STR INRA189标记PCR产物测序分型由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 牦牛Y染色体分子标记引物信息

1.3 数据分析

将测序数据使用Chromas 2.3软件进行人工核对，确保数据的准确性。用BioEdit7.2.5软件[10]对32头同德牦牛5个Y-SNPs标记(SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY3 和OFD1Y10)测序结果进行多序列比对分析，检测每个标记中的SNP位点。同时，用GeneMarker 1.91 软件[11]对每头牦牛的Y-STRINRA189标记测序分型结果进行分析，确定其等位基因大小。通过2种标记联合分型确定每头公牦牛的Y染色体单倍型及单倍型组。后采用DnaSP5.10.01[12]和Arlequin3.11软件[13]确定同德牦牛的Y染色体单倍型数目，计算其Y染色体单倍型多样度(Hd)大小。用Network10.1软件[14]基于不同单倍型间的核苷酸变异绘制网络中介图(Median-Joining, MJ)以揭示单倍型(组)间的系统发育关系。

2 结 果

2.1 同德牦牛Y染色体标记的多态性检测

对32头同德牦牛5个SNPs 标记即SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY3 和OFD1Y10进行PCR纯化产物双向测序，获得的片段长度分别为969 bp、470 bp、290 bp、971 bp和763 bp。对各标记测序结果进行多序列比对分析，除检测到先前Ma等[4-5]确定的10个Y-SNPs外，本研究在同德牦牛AMELY3标记中首次检测到一个新的Y-SNP位点(即g.719 C>T)(图1)。在对同德牦牛Y-STRINRA189标记分型分析中，本研究共检测到155 bp、157 bp和159 bp 3个等位基因(图2)。

图1 同德牦牛AMELY3标记新的Y-SNP(g.719 C>T)位点测序峰图

图2 同德牦牛Y-STR INRA189 标记分型结果

2.2 同德牦牛Y染色体单倍型确定及多样度大小

参照先前研究报道中其他牦牛品种(群体)Y染色体单倍型的确定方法[3-5]，本研究对同德牦牛群体进行Y染色体单倍型确定和综合分析，结果共确定了6种Y染色体单倍型，即Y1H1、Y1H2、Y1H3、Y1H4、Y1H5和Y2H6(表2)。其中Y1H1为优势单倍型，共有15个个体共享，占总数的47%；Y2H6有8个个体共享，占总数的25%；Y1H5有4个个体共享，占总数的13%；Y1H2有3个个体共享，占总数的9%；而Y1H3和Y1H4单倍型均只包含1个个体，频率最低，各占总数的3%，为稀有单倍型。计算结果表明，同德牦牛Y染色体单倍型多样度(Hd)大小为0.714±0.060。

表2 同德牦牛Y染色体单倍型(组)信息

2.3 同德牦牛Y染色体单倍型系统发育分析

对同德牦牛6种Y染色体单倍型构建网络关系图(图3)，结果显示：6种Y染色体单倍型分为2个大的单倍型组/支系(即Ⅰ和Ⅱ)。其中，Ⅰ单倍型组/支系包括5种单倍型(即Y1H1、Y1H2、Y1H3、Y1H4和Y1H5)，占总数的75%；而Ⅱ单倍型组/支系仅含有Y2H6一种单倍型，占总数的25%，提示同德牦牛由2个大的父系单倍型组/支系组成，以Ⅰ单倍型组/支系为主，有2个父系起源。

图3 同德牦牛6种Y染色体单倍型网络关系图注：图中圆面积大小与各单倍型频率大小成正比

3 讨 论

Y-SNP和Y-STR 作为2种主要的Y染色体分子标记，在开展哺乳动物父系遗传多样性、群体遗传结构、起源等研究中发挥着重要的作用[3-7,15-18]。在先前牦牛的父系遗传研究中，Li等[3]发现SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY2和OFD1Y10标记中6个Y-SNPs可用于牦牛父系遗传分析，在高原、环湖和天祝白牦牛中共确定了3种单倍型，提示各品种具有丰富的Y染色体遗传多样性。Ma等[4]对青海9个牦牛品种(群体)(即曲玛莱、祁连、天峻、唐古拉山、郭勒木德、岗龙、雪多、大通和环湖牦牛)的父系遗传分析中，表明郭勒木德群体具有最丰富的父系遗传多样性(Hd=0.706±0.038)。而在中国15个家牦牛和1个野牦牛品种/群体的父系遗传分析中，马志杰[5]在Li等[3]研究的基础上在OFD1Y10标记中发现4个新的Y-SNPs，共确定了14 种Y染色体单倍型，表明家、野牦牛拥有丰富的父系遗传多样性，但野牦牛的父系遗传多样性(Hd=0.821 4±0.100 7)高于家牦牛(Hd=0.696 4±0.014 1)；家牦牛品种(群体)中巴州牦牛的父系遗传多样性最高(Hd=0.727 3±0.066 7)，帕里牦牛的父系遗传多样性最低(Hd=0.117 4±0.073 2)。在本研究中，基于相同的5个牦牛Y-SNPs标记(即SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY3和OFD1Y10)和1个Y-STR标记(即INRA189)，在对同德牦牛的父系遗传分析中首次在AMELY3标记中发现一个新的Y-SNP(g.719 C>T)，这不仅说明同德牦牛群体含有不同于其他牦牛品种(群体)特殊的父系遗传信息，而且进一步表明牦牛Y染色体遗传变异比较丰富且蕴含着丰富的遗传信息。在本研究中，在同德牦牛中共确定了6种Y染色体单倍型(即Y1H1、Y1H2、Y1H3、Y1H4、Y1H5和Y2H6)，与先前Li等[3]和马志杰[5]的研究报道相比，其单倍型数目与大通、麦洼、巴州牦牛所拥有的单倍型数目(6种)相同，只低于高原牦牛的单倍型数目(7种)，而高于其他品种(群体)所拥有的Y染色体单倍型数(2～5种)。与此同时，本研究表明同德牦牛的Y染色体单倍型多样度(Hd)为0.714±0.060，这与我国其他家、野牦牛品种(群体)Y染色体单倍型多样度值(0.117～0.821)相比[5]，该值也较高，仅低于野牦牛(0.821±0.101)和巴州牦牛(0.727±0.067)的相应值[5]，说明同德牦牛具有丰富的父系遗传多样性。同德牦牛所处地理位置特殊，母系遗传多样性较高(Hd= 0.935±0.023)[9]，而本研究进一步揭示其具有丰富的父系遗传多样性且拥有特殊的父系遗传信息，说明该群体蕴含丰富的遗传变异，可为牦牛品种(品系)培育提供良好的素材，故建议继续深入开展同德牦牛基因组、转录组及蛋白组学等方面的系统研究，为其种质资源的合理保护和开发利用奠定基础。

动物的起源和系统发育研究有助于揭示其进化历史、系统发育关系和复杂的遗传背景。先前对牦牛父系起源的研究中，表明我国家、野牦牛均拥有2个明显的父系支系，提示牦牛有2个父系起源[3-6]。在本研究中，对同德牦牛6种Y染色体单倍型构建的网络关系图中，6种Y染色体单倍型也分为明显的2个大分支，表明同德牦牛也由2个大的父系支系组成，有2个父系起源，这与前人对其他牦牛品种(群体)的研究结果一致[3-6]。

4 结 论

青海省同德牦牛群体具有丰富的父系遗传多样性，蕴含特殊的父系遗传信息，由2个父系支系组成，拥有2个父系起源。