夏南牛无角性状的分子鉴定技术及应用

曾璐岚，郝新兴，祁兴磊，林凤鹏，黄永震，党瑞华，蓝贤勇，陈 宏，雷初朝﹡

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.河南省泌阳县畜牧局，河南 泌阳 463700)

夏南牛无角性状的分子鉴定技术及应用

曾璐岚1，郝新兴2，祁兴磊2，林凤鹏2，黄永震1，党瑞华1，蓝贤勇1，陈 宏1，雷初朝1﹡

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.河南省泌阳县畜牧局，河南 泌阳 463700)

[目的]旨在检测夏南牛公牛和母牛的有角与无角性状及其相应的基因型，为夏南牛无角品系的选育奠定分子遗传学基础。[方法]采用PCR扩增，琼脂糖电泳分型的方法。[结果]通过对夏南牛P202ID位点进行检测，发现其基因型有三种，即PC/PC，PC/prs和Prs/Prs，其基因型频率分别为3.54%，78.76% 和 17.70%。分子鉴定结果表明，113头夏南牛的基因型与其无角与有角性状一致。[结论]可利用单倍型P202ID有效鉴定夏南牛无角与有角性状，并用于夏南牛无角品系的选育，具有重要推广价值。

夏南牛；无角性状；基因型；分子鉴定

牛角是牛科动物特有的组织结构，它由外角质蛋白层和中空的骨组成[1]。角的发育依赖于不同的组织及其相互作用[2,3]。驯化前，角对动物的自卫非常重要。但是近年来，随着畜牧业的发展，特别是进入集约规模化饲养后，角容易对动物或饲养人员造成伤害。所以，幼年时去角在现代化养牛业中已经成为一种公认的实践管理方法，但是这种方法不仅加大了畜牧场的工作量，而且会对动物造成一定程度的伤害，有违动物福利原则[4]。在一些发达国家，如欧盟，已经启动了关于禁止动物阉割和去角的ALCASDE工程[5]，而德国的动物福利组织也联合政府积极推广无角公牛的精液，从而使牛群繁育向无角牛的方向发展。因此，通过对角性状的研究，利用分子遗传学技术鉴定并培育无角肉牛新品系成为解决经济利益与动物福利原则冲突的最佳方法。

牛无角属于显性遗传[3,6]。1993年Georges等[7]通过微卫星标记推测出控制牛角性状的基因，并将其定位在1号染色体上。通过全基因组微卫星筛选，筛选到BTA1上3个与牛的有角与无角性状密切相关的标记，分别为BM6438、TGLA49和SOD1[8-10]。2005年，Drgemüller等[11]对1号染色体一段4Mb区域进行精确分析，并把角性状基因的区域缩小到1Mb。Cargill 等[12]在2008年发现BTA1上的13个SNPs与角性状密切相关。Li等[13]在北欧亚牛发现2个与无角性状相关标记即SOD1和AGLG17，分别位于BTA1和BTA20。Medugorac等[14]研究发现，牛6个无角突变位点(P5ID，PG1654405A，PC1655463T，PC1768587A，P80kbID和P202ID)控制牛的无角性状，其中前5个突变位点是连锁的，为荷斯坦奶牛特有的无角基因，命名为PF，除奶牛外，其他牛的无角性状均为P202ID位点控制，其无角基因命名为PC；牛有角性状则由prs基因控制。PF、PC、Prs是3个复等位基因；而PF、PC是2个等显性等位基因，是相互独立的2个遗传系统，彼此不重组，其中任意一个突变位点存在牛都表现为无角性状。因此，基于这6个无角突变位点就能鉴定该牛是无角牛还是有角牛。本试验旨在利用分子遗传学技术鉴定夏南牛公牛和核心群母牛的有角与无角性状，所选夏南牛血统纯正，无荷斯坦奶牛血统。因此，本研究通过PCR扩增方法对夏南牛P202ID位点进行检测，就可以利用该突变位点有效鉴定夏南牛角的有无及其相应的基因型，为夏南牛无角品系的选育奠定分子遗传学基础。

1 材料与方法

1.1 样本采集

本研究采集了113头夏南牛耳组织样(采自河南省泌阳县夏南牛保种场)；其中93头无角夏南牛 (其中公牛2头，母牛91头)、20头有角夏南牛(公牛1头，母牛19头)。-20℃保存。

1.2 基因组DNA提取及PCR扩增

利用酚-氯仿法提取基因组DNA。根据Medugorac等[14]发表的引物，正链序列为：5′-TCAAGAAGGCGGCACTATCT-3′; 反链序列为: 5′-TGATAAACTGACCCTCTGCCTATA-3′，由华大基因科技股份有限公司合成引物。PCR反应体系为12.5 μL，扩增条件：95℃预变性4 min；94℃变性40s，59℃退火40s，72℃延伸30 s，32个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。分别以超纯水、夏南牛的基因组DNA为模板进行PCR扩增，其中超纯水作为空白对照。采用1.0%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物，在凝胶成像系统下观察并拍照。

2 结果与分析

本研究利用合成的一对引物，共扩增了92头无角(其中公牛1头，母牛91头) 夏南牛、20头(公牛1头，母牛19头)有角夏南牛的基因组DNA，扩增结果如图1所示；对夏南牛P202ID位点的PCR扩增片段大小、基因型及基因型频率进行统计，结果见表1。从图1和表1可以看出，夏南无角牛又分纯合无角牛与杂合无角牛，纯合无角夏南牛(母牛4头)的基因型为PC/PC，只有1条扩增带571 bp，其频率为3.54%；杂合无角夏南牛(其中公牛2头，母牛87头)的基因型为PC/Prs，有2条扩增带571 bp和369 bp，频率为78.76%，无角夏南牛总的频率为82.30%；有角夏南牛(公牛1头，母牛19头)为隐性纯合子，其基因型为Prs/Prs，只有1条扩增带369 bp，其频率为17.70%。因此，本研究的结果可以用于夏南牛中无角与有角性状的分子鉴定，也适用于国内其他黄牛品种无角与有角性状的分子鉴定。这个标记简单实用，可以用于夏南牛无角品系的选育，具有重要推广价值。

表1 夏南牛P202ID位点的PCR产物大小、基因型与基因型频率

3 讨论

角是牛重要的外貌性状，但是在进入集约规模化饲养后，牛角不仅容易在集中运输和屠宰过程中对牛只和饲养人员造成伤害，还可能在饲养过程中破坏圈舍，损坏设施，从而造成不必要的经济损失[15]，因此，长期以来，牛的无角表型都是选择和研究的目标。世界各国的科学家在培育新的肉牛品种时都非常注重培育无角牛。目前已经成功培育出多个无角品种[16]。例如，美国就曾利用英国最古老的肉用品种牛之一的短角牛育成无角短角牛。我国也已培育出大通牦牛无角新品系[17]。随着时代的发展，分子遗传技术正逐步与经典的育种方法相结合应用于牛的育种。Medugorac[18]等通过全基因组测序，发现在POLLED位点上有121-kb的片段从黄牛渗入到牦牛中，导致牦牛也变成了无角，这在很大程度上促进了牦牛无角品系的培育。在奶牛上，Carlson等[19]利用基因编辑技术去除牛角，从而培育出无角奶牛，以提高动物福利及方便规模化管理。

图1 夏南牛无角与有角性状的基因型注：1为杂合无角牛，3为纯合无角牛，2、4为有角牛，5为空白对照

夏南牛是以夏洛来牛为父本，南阳牛为母本杂交培育而成的我国第一个肉牛品种，具有耐粗饲、适应性强、生长发育快、肉质好等优点，具有广阔的推广应用前景[20]。夏南牛中既有有角牛，也存在无角牛。目前夏南牛依旧采用人工方法去角，但人工去角法往往伴随着应激和疼痛，还有可能对牛的生长发育造成影响[21]，所以培育夏南牛无角新品系是一种更为有效的途径。本研究利用PCR方法对113头夏南牛(其中93头为无角牛，20头为有角牛)单倍型P202ID位点进行检测，快速有效鉴定其无角与有角性状及相应的基因型，结果显示113头夏南牛基因检测结果与其无角与有角性状完全相符，表明本方法可以用于夏南牛与其他黄牛品种无角与有角性状基因的分子鉴定，具有重要实践意义。

4 应用

利用本研究的分子遗传学技术可以快速鉴定杂合无角牛、纯合无角牛与有角牛，因此，该技术可以直接用于夏南牛无角品系的培育，加快选育进程。

(1)利用纯合无角种公牛与纯合无角母牛(基因型均为PC/PC，只有1条扩增带571 bp)进行交配，后代均为纯合无角牛，这是最佳的夏南牛无角品系选育方案。

(2)鉴于夏南无角母牛95.6%(87/91)均为杂合无角牛的事实，利用纯合无角种公牛(基因型均为PC/PC，只有1条扩增带571 bp)与杂合无角母牛(基因型为PC/Prs，有2条扩增带571 bp和369 bp)交配，后代100%为无角牛，但有50%为杂合无角牛。

(3)在培育夏南牛无角品系时，优先推荐纯合无角夏南牛作种公牛，禁止有角夏南牛作种公牛，也不建议使用杂合无角夏南牛作种公牛。但目前鉴定的2头夏南种公牛均为无角杂合子，因此需要对其它夏南种公牛或后备种公牛进行PCR鉴定，选出无角夏南种公牛与纯合子或杂合子无角母牛进行交配，以加快夏南无角牛新品系的培育进程。

(4)本研究的优点是省钱、省时、工作量小。从提取DNA到有角牛与无角牛性状的鉴定，1天时间即可完成，无需测序，大大降低了成本和工作量，提高了工作效率。

[1] Dyce K M,Sack W O,Wensing C J G.Textbook of veterinary anatomy[M].Holand:Elsevier,1987:921.

[2] Capitan A,Grohs C,Weiss B,etal.A newly described bovine type 2 scurs syndrome segregates with a frame-shift mutation in TWIST1[J].Plos One,2011,6(7):e22242.

[3] Dove W F.The physiology of horn growth:A study of the morphogenesis,the interaction of tissues,and the evolutionary processes of a mendelian recessive character by means of transplantation of tissues[J].Journal of Experimental Zoology Part B Molecular & Developmental Evolution,2010,69(3):347-405.

[4] Graf B,Senn M.Behavioural and physiological responses of calves to dehorning by heat cauterization with or without local anaesthesia[J].Applied Animal Behaviour Science,1999,62(2-3):153-171.

[5] Oliver M A,Thomas C,Bonneau M,etal.Study on the improved methods for animal-friendly production,in particular on alternatives to the castration of pigs and on alternatives to the dehorning of cattle[J].University West England,2009,18(5):51-65.

[6] White W T,Ibsen H L.Horn inheritance in Galloway-Holstein cattle crosses[J].Journal of Genetics,1936,32(1):33-49.

[7] Georges M,Drinkwater R,King T,etal.Microsatellite mapping of a gene affecting horn development in Bostaurus[J].Nature Genetics,1993,4(2):206-210.

[8] Barendse W,Armitage S M,Kossarek L M,etal.A genetic linkage map of the bovine genome[J].Nature Genetics,1994,6(3):227-235.

[9] Bishop M D,Kappes S M,Keele J W,etal.A genetic linkage map for cattle[J].Genetics,1994,136(2):619.

[10] Schmutz S M,Marquess F L,Berryere T G,etal.DNA marker-assisted selection of the polled condition in Charolais cattle[J].Mammalian Genome,1995,6(10):710-713.

[11] Dr gemüller C,W hlke A,M mke S,etal.Fine mapping of the polled locus to a 1-Mb region on bovine Chromosome 1q12[J].Mammalian Genome,2005,16(8):613-620.

[12] Cargill E J,Nissing N J,Grosz M D.Single nucleotide polymorphisms concordant with the horned/polled trait in Holsteins[J].BMC Research Notes,2008,1(1):1-9.

[13] Li M H,Isotouru T,Laurén H,etal.A microsatellite-based analysis for the detection of selection on BTA1 and BTA20 in northern Eurasian cattle (Bostaurus) populations[J].Genetics Selection Evolution,2010,42(1):32.

[14] Medugorac I,Seichter D,Graf A,etal.Bovine Polledness - An Autosomal Dominant Trait with Allelic Heterogeneity[J].Plos One,2012,7(6):e39477.

[15] Shaw F D,Baxter R I,Ramsay W R.The contribution of horned cattle to carcase bruising[J].Veterinary Record,1976,98(13):255.

[16] Lauwerier R C G M.Polled cattle in the Roman Netherlands[J].Livestock Science,2015,179:71-79.

[17] 梁春年,阎萍,郭宪,等.大通牦牛无角新品系培育的意义及思路[J].黑龙江畜牧兽医,2010,(19):51-52.

[18] Medugorac I,Graf A,Grohs C,etal.Whole-genome analysis of introgressive hybridization and characterization of the bovine legacy of Mongolian yaks[J].Nature Genetics,2017,49(3):470.

[19] Carlson D F,Lancto C A,Zang B,etal.Production of hornless dairy cattle from genome-edited cell lines[J].Nature Biotechnology,2016,34(5):479.

[20] 祁兴磊,谌启亮,卢桂松,等.夏南牛牛肉品质的研究[J].中国牛业科学,2012,38(2):12-14.

[21] Scheper C,Wenschdorendorf M,Yin T,etal.Evaluation of breeding strategies for polledness in dairy cattle using a newly developed simulation framework for quantitative and Mendelian traits[J].Genetics Selection Evolution,2016,48(1):50.

MolecularIdentificationandApplicationofPolledTraitinXiananCattle

ZENG Lu-lan1,HAO Xin-xing2,QI Xing-lei2,LING Feng-peng2,HUANG Yong-zhen1,Dang Rui-hua1,LAN Xian-yong1,CHEN Hong1,LEI Chu-zhao1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi. 712100,China; 2.AnimalHusbandryBureauinBiyangCounty,Biyang,Henan, 463700,China)

[Objective]The aim of this study was to identify the genotype about polled and horned traits of Xianan cattle, which would provide molecular genetics basis for further selection and breeding of polled Xianan cattle.[Method] PCR amplification and agarose gel electrophores methods were used to detect the genotype of individuals.[Result]After detecting the haplotype P202ID in Xianan cattle, three genotypes were detected. The frequencies of PC/PC, PC/Prs and Prs/Prs genotypes in 113 Xianan cattle were 3.54%, 78.76% and 17.70%, respectively. Importantly, the results showed that the genotypes of 113 Xianan cattle samples were completely consistent with the corresponding polled and horned traits.[Conclusion]The haplotype P202ID is an easy and effective marker to identify the polled and horned traits of Xianan cattle, and it can be used for the breeding of polled Xianan cattle, which is worth of extending and applying in cattle breeding.

Xianan cattle; polled trait; genotype; molecular identification

2017-05-05接收日期2017-05-25

国家肉牛牦牛产业技术体系(CARS-38)资助。

曾璐岚(1994-)，女，湖南常宁人，硕士研究生，主要从事动物遗传资源研究。

*通讯作者：雷初朝(1968-)，男，湖南常宁人，教授，博士生导师，主要从事牛遗传资源研究。

S823

A

1001-9111(2017)04-0027-03