疯草毒素对瘤胃细菌发酵的影响

白延琴，时国峰，辛亚平

(1.子长县畜牧兽医局史家畔畜牧兽医站，陕西 子长，717300；2.甘肃张掖市畜牧兽医局，甘肃 张掖，734000；3.西北农林科技大学动物科技学院，中国 杨凌，712100)

疯草毒素对瘤胃细菌发酵的影响

白延琴1，时国峰2，辛亚平3*

(1.子长县畜牧兽医局史家畔畜牧兽医站，陕西 子长，717300；2.甘肃张掖市畜牧兽医局，甘肃 张掖，734000；3.西北农林科技大学动物科技学院，中国 杨凌，712100)

[目的]为了探讨疯草毒素对瘤胃细菌的生长和发酵的影响；[方法]分别配制含有0.18 mg/mL、0.36 mg/mL、0.72 mg/mL、1.44 mg/mL、2.88 mg/mL、5.76 mg/mL疯草毒素的培养基对瘤胃混合细菌进行体外培养。用分光光度计实时测定培养物的OD值，培养结束后用pH计和凯氏定氮法测定了发酵终产物的pH值和氨氮浓度。在正常生长条件下，对瘤胃细菌的生长曲线进行了测定。[结果]发现，在培养过程中，不同浓度的疯草毒素对瘤胃细菌的生长无显著影响(P>0.05)。培养后培养液的pH值、氨氮浓度无显著差异(P>0.05)。[结论]研究表明，体外培养条件下疯草毒素对瘤胃细菌的发酵无显著影响。瘤胃细菌的生长曲线为：Y=0.79/(1+7.81*e-0.942*x)(X=t，Y=OD值)。

疯草毒素；瘤胃细菌；生长；发酵

近年来，应用微生物降解毒物、毒素一直是国内外研究的热点，研究内容涉及到毒物(毒素)在环境中的降解转化过程、降解微生物的筛选、鉴定、降解基因和降解机理的研究、基因工程菌的构建等[1]。牛羊等反刍动物的瘤胃由于具有一些特殊功能的细菌，使反刍动物在采食一些含有一定剂量的有毒有害物质的饲料、饲草时不受其毒害。牛羊的瘤胃中可能存在能够分解利用疯草毒素的微生物。本试验用用体外培养法初步探讨疯草毒素对瘤胃细菌生长与瘤胃发酵特征的影响，为从瘤胃中分离能够降解疯草毒素的微生物等相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

带瘤胃瘘管秦川母牛，日粮中精料混合料4 kg/d，青贮料10 kg/d，苜蓿 1 kg/d，麦秸2 kg/d。疯草毒素、磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、硫酸镁(MgSO4)、氯化钙(CaCl2)。pHS-3精密pH计、AG-2厌氧培养装置、制冰机。

1.2 方法

1.2.1 瘤胃液的采集及处理

(1) 采用口腔插管法采集200 mL的牛瘤胃液放入冰盒中带回实验室后，放入39℃培养箱30min。

(2) 用移液管取容器中间部分30 mL装入50 mL离心管中，在750×g ，10℃的条件下离心10 min。

(3) 取出离心后，取上清液置于新的50 mL离心管中，在12 000×g，10℃下离心15 min。

(4) 取出离心后的瘤胃液，去掉上清液，沉淀部分用30 mL 磷酸缓冲液冲洗，然后在12 000×g 、10℃的条件下离心15 min。

(5)去掉上清液，沉淀部分用30 mL磷酸缓冲液再冲洗一次，然后在12 000×g、10℃条件下离心15 min。

(6)去掉上清液，加入20 mL磷酸缓冲液冲洗混匀，然后放入冰水混合物中，不断通入二氧化碳，保持厌氧状态。

(7)将洗涤后的瘤胃混合细菌振荡混匀后，分别加入装有处理好的含培养基的试管中，每管加0.5 mL。

1.2.2 OD值测定 接种好后立即放入39°C水浴锅培养。用分光光度计测定培养过程中光密度的变化，起始时测1次，培养的前2 h每1 h测1次，以后每30 min测1次，做好记录。

1.2.3 pH值测定

1) 培养结束后，将测完OD值的18个试管中的培养物转移至10 mL的离心管，在1 2000×g、10℃条件下离心5 min。

2) 每个管取上清液3.6 mL，分装至两个2 mL离心管中，每管1.8 mL，放入-20℃冰箱中保存备用。

3) 将10 mL离心管中剩下的微生物培养基测pH值。

4) 测完pH值后，倒掉上清液，沉淀的细菌在-20℃冰箱中保存备用。

1.2.4 NH3氮测定

1) 每管每次分别用微量加样器量取0.5 mL液体样，放入消化管中，加入3 g轻质氧化镁和1 mL液体石蜡油，再沿管壁加入30 mL蒸馏水，直接蒸馏，蒸馏时使冷凝管末端在吸收液面以下蒸馏4 min，然后使冷凝管末端在在吸收面上端再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端。

2) 用10 mL加入2～3滴混合指示剂的2%的硼酸吸收。

3) 用标准盐酸标定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点，每管测两次，记录盐酸体积。

1.3 数据的统计与分析

运用SPSS软件的非线性回归过程拟合Logisti模型(模型方程为：Y=A/(1+Be-Kt))参数的最优估计值A、B、k，建立生长曲线模型，推算出拐点OD值、达到拐点OD值的时间和最大增加OD值。应用Microsoft excel软件中t检验功能进行差异性检验分析。

2 结果与分析

2.1 瘤胃细菌的生长曲线

利用SPSS软件非线性拟合过程拟合了瘤胃细菌正常生长的拟合模型的参数估计见表1。从表1中可以看出参数的最优估计值A、B、k分别为0.79、7.81、0.942，达到拐点的OD值、拐点时间、最大增加OD值分别为0.395、2.1820、0.1860，曲线的拟合度R2为0.964，曲线的拟合较好。曲线整体呈“S”增长趋势，先上升后降低，符合正常细菌的生长曲线。

2.2 不同浓度疯草毒素对瘤胃发酵特征的影响

培养结束后，不同浓度疯草毒素培养管中的pH值和氨氮浓度见表2。处理组与对照组差异不显著(P>0.05)，说明不同浓度疯草毒素对瘤胃发酵无显著影响。

表1 非线性生长模型的表达式及参数

2.3 不同浓度的疯草毒素对瘤胃细菌生长的影响

添加不同浓度疯草毒素的处理组和对照组的瘤胃细菌在不同测定时间点的OD值见表3。各处理组与对照组OD值变化不显著(P>0.05)，说明不同浓度疯草毒素对瘤胃细菌的生长无显著影响，各时间点不同处理之间瘤胃细菌的OD值变化差异不显著(P>0.05)，由此说明不同浓度的疯草毒素对瘤胃细菌生长无显著影响。

表3 不同浓度的疯草毒素瘤胃混合细菌生长(OD值，X±S)的影响

3 讨论

通过测瘤胃混合细菌的OD来间接了解细菌的生长情况，由细菌的OD值绘成的生长曲线反映了细菌在培养中所表现出来的生长和繁殖的规律，实验得出的瘤胃混合细菌体外培养生长曲线与其他报道中的瘤胃混合细菌正常生长曲线一致，拟合度较好[2]。

B.S.Obeidat等对苦马豆素的不同接触途径对绵羊的血清成分，瘤胃特征和营养代谢的影响进行了研究，其用苦马豆素与绵羊进行瘤胃接触、皱胃接触和静脉接触方法来确定疯草毒素是否对瘤胃特征，血清成分，消化代谢率和N保留存在影响[3]。当绵羊接触到苦马豆素时发生亚中毒，但对瘤胃发酵，营养消化率和N保留影响不显著(P>0.05)。试验采用体外培养方法，将含有不同浓度疯草毒素的处理组与不加疯草毒素的对照组分别进行pH值、氨氮浓度和挥发性脂肪酸浓度的比较，结果发现疯草毒素对瘤胃内环境无显著影响(P>0.05)，这与B.S.Obeidat等报道一致，无论是饲喂还是体外培养疯草毒素对瘤胃发酵都无显著影响[4]。

通过对瘤胃内是否存在可降解利用疯草毒素的细菌进行研究，对照组和处理组瘤胃细菌在各时间点OD值得测定和比较，发现不同浓度的疯草毒素对瘤胃内细菌没有显著影响(P>0.05)[5]。不能确定瘤胃内没有可降解利用疯草毒素的微生物，因为疯草毒素作用机制主要是能强烈地和特异性地抑制溶酶体α-甘露糖甙酶I和高尔基氏体α-甘露糖甙酶II的活性，这种酶并不是瘤胃细菌的主要代谢过程，疯草中毒是一个逐渐累积的过程[6]。由于条件所限，不能肯定瘤胃内是否有可降解利用疯草毒素的细菌存在。但为可降解疯草毒素的细菌的提取和分离进行了探索，对疯草毒素的防治提供了新方法。

4 结论

瘤胃混合细菌的生长曲线为：Y=0.79/(1+7.81*e-0.942x)(X=t，Y=OD值)；体外培养条件下，疯草毒素对pH值、氨氮浓度等发酵特征无显著影响；疯草毒素对瘤胃混合细菌的生长无显著影响。

[1] 黄荣福，沈颂东.西藏草原豆科毒害植物(疯草)的种类与分布[J].动物毒物学，1998,13(1-2):13-17.

[2] 王建华，张志恒，高巨星.西藏阿里地区动物“醉马草”中毒病调查报告[J].动物毒物学，1998,13(12):22-27.

[3] 刘栩,王英东.甘肃棘豆草粉添加饲喂猪试验血液学分析[J].中兽医医药杂志,1997,(1):8-10.

[4] 童德文，曹光荣，李绍君.甘肃棘豆中苦马豆素的分离与鉴定[J].西北农林科技大学学报，2001,29(3):5-7.

[5] 陈学诚，陈立昕，邓晓丽，等.二恶英、有毒二恶英及其类似化合物[J].河北工业科技,2002，19(3):46-49.

[6] 杜秀英，竺乃恺，夏希娟，等.多氯代二苯并-对-二恶英的微生物降解[J].环境科学,2001,22(3):97-99.

EffectsofLocoweedToxinsontheFermentationofRumenBacteria

BAI Yan-qin1，SHI Guo-feng2，XIN Ya-ping3*

(1.TheAnimalHusbandryandVeterinaryBureauinShijiapan,Zichang,Shaanxi, 717300,China; 2.TheAnimalHusbandryandVeterinaryBureauofZhangye,Zhangye,Gansu, 734000,China; 3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi, 712100,China)

[Objective] The aim of this study was to explore the effect of locoweed toxin on rumen bacterial growth and fermentation. [Method] The medias were prepared containing 0.18 mg/mL, 0.36 mg/mL, 0.72 mg/mL, 1.44 mg/mL, 2.88 mg/mL and 5.76 mg/mL and 57.6 mg/mL locoweed toxin, respectively. Then, the madias containing locoweed toxins were prepared to culture mixed rumen bacteria in vitro. The pH values and ammonia concentration in fermentation end product were monitored and the normal growth curve of rumen bacteria was constructed based on the relationship between OD values and culture time.[Result] It showed that no effects of locoweed toxin at different concentrations on rumen bacteria growth were observed (P>0.05). After the culture, the pH and ammonia concentration in the fermentation end products showed no significant difference (P>0.05). [Conclusion] The locoweed toxin has no significantly effects on the fermentation of rumen bacteria in vitro. Under the conditions in vitro, the growth curve of mixed rumen bacterial was as follows: Y=0.79/(1+7.81*e-0.942*x) (X=t,Y= OD value,R2=0.964).

locoweed toxin; rumen bacteria; growth; fermentation

2017-03-18接收日期2017-05-15

秦川肉牛种质创新及高效健康养殖关键技术集成与示范、富硒畜禽水产饲料研制开发及产业化及陕西省奶牛产业技术体系资助。

白延琴(1985-)，女，陕西子长人，本科，助理畜牧师，主要从事畜牧技术推广工作。

*通讯作者：辛亚平(1965-),男,陕西扶风人,副教授,主要从事养牛教学与研究工作。

S823

A

1001-9111(2017)04-0030-04