非典型肠致病性大肠杆菌的分离鉴定及临床病例的病理学观察

刘 朋，程子龙，陈 萌，刘思当

(山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271000)

*通讯作者：刘思当，教授，博士，博士生导师。

非典型肠致病性大肠杆菌的分离鉴定及临床病例的病理学观察

刘 朋，程子龙，陈 萌，刘思当

(山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271000)

2016年6月，山东泰安市一家牛场发生犊牛持续性腹泻，并引起很快死亡。[目的]:为了弄清致病原因。[方法]:根据临床症状进行了病理剖检,及时采取应对措施,组织病理学观察过程发现。[结果]:犊牛起病排黄色水样腹泻物,随后血便,并很快死亡,剖检病变为肝脏与腹膜粘连，脾脏肿大，呈暗紫色，小肠浆膜出血，腹腔内有积液；镜检病变为间质性肺炎、出血性变质性肾炎、败血脾、浆液性淋巴结炎和变质性心肌炎。根据National Center for Biotechnology Information(NCBI)中的BLAST检索结果显示，这株大肠杆菌血清型与O157:H16菌株血清型非常接近。[结论]:最终确定为非典型性大肠菌感染所致。因此,通过注射头孢噻呋钠，口服新霉素等综合防治措施，使病情得以迅速恢复。

非典型肠致病性大肠杆菌；犊牛；出血性腹膜炎；病理学观察

1 发病背景

山东省泰安市某牛场从事奶公牛育肥，现该场有40头奶公牛。2016年6月，牛群发生持续性腹泻，起初排黄色水样腹泻，随后排血便，死亡2头。养殖户将其中一头送到本实验，本实验室通过临床症状观察和病理剖检，诊断为出血性腹膜炎，随后采集病料做组织病理学观察和病原学检测。

(3) 用白色黏土搓出直径约0.5cm的长条若干，连接各个直立菌丝的基部，并分别在两个泡沫板侧面做出根状结构，作为两种真菌的营养菌丝。

2 临床症状

病牛主要以腹泻为主，体温略有升高，机体消瘦，精神沉郁，食欲下降，眼窝凹陷，长时间腹泻导致机体脱水。

1993年4月6日，我带着6岁的儿子从北京出发，乘坐东航MU583班机经上海飞往美国洛杉矶。那是架麦道MD11型客机。途中，飞机飞行一直很平稳，到高度为10100米时，大家觉得似乎已经平安抵达，人人脸色轻松。不料，飞机忽然抖动了一下，我的头顶被一巨大的平板状物体猛拍一记，一瞧，是飞机天花板！我飘浮在空中，身不由己，处于严重失控失重状态。后来才得知，这可能是飞行员起身时，无意中碰到了升降控制按钮。

利用放电声音识别来检测高压开关柜绝缘破坏情况,其核心思想是通过对放电声音训练样本进行训练,划分样本空间,完成分类器的设计,从而提高放电声音的识别率,其系统结构图如图1所示。首先,采集高压开关柜绝缘破坏放电声音训练样本;然后对训练样本预处理,提取能量特征和显著性特征作为混合特征参数,划分样本空间,完成分类器的训练;最后,将待测放电声音进行同样的预处理、特征参数提取后送入分类器完成最终的检测识别。经过训练的分类器可以识别出高压开关柜绝缘破坏时的放电声音,从而进行实时故障检测,实时显示高压开关柜的工作状态。

3 病理变化

腹腔有血液渗出，继发腹腔感染，引起腹膜炎，使肠管和脏器、腹膜粘连(图1)，瘤胃大网膜出血。肝脏肿大，表面被一层灰白色薄膜包裹(图2)。脾脏充血、出血，呈黑紫色，表面也有薄膜包裹(图3)。心外膜出血，肺尖叶、心叶轻度实变，肾淤血肿大。肠系膜出血，肠浆膜面出血。

3.1 剖检病变

图1出血性腹膜炎图2肝脏粘连图3脾脏表面被白色薄膜包裹炎

根据临床表现、剖检病变(出血性腹膜炎、肝包膜炎、脾包膜炎)、病理组织学观察(变质性心肌炎、间质性肺炎、充血性变质性肾炎、浆液性淋巴结炎、败血脾)及病原学检查，诊断为非典型肠致病性大肠杆菌(aEPEC)感染所致。

肝窦状隙扩张充血，肝细胞变性。心肌纤维颗粒变性，心间质轻度出血(图4)。肺泡壁增宽，肺泡上皮细胞脱落(图5)。肾小动脉充血，肾小管上皮细胞颗粒变性(图6)。因浆液渗出，淋巴小结内淋巴细胞疏松，淋巴窦扩张(图7)。整个脾组织被红细胞取代，脾实质坏死消失，只见少量零散的淋巴细胞，呈败血脾病变(图8)。

4 病原学检测

除了EHEC血清型O157:H7 外，O157血清组还包括其它菌株，血清型O157:H45菌株属于EPEC，而血清型O157:H16菌株属于aEPEC。典型肠致病性大肠杆菌(tEPEC)既含有肠细胞脱落位点(LEE)毒力岛外，还含有被称为EPEC黏附因子(EAF)的质粒，而非典型肠致病性大肠杆菌(aEPEC)仅含LEE毒力岛，不含EAF质粒[2]。aEPEC与EHEC相比，缺少合成类志贺毒素的能力。因此，aEPEC似乎是一类新病原体。

根据National Center for Biotechnology Information(NCBI)中的BLAST检索结果显示，这株大肠杆菌血清型与aEPEC O157:H16菌株血清型相似性为97.6%(图10)。

图9 “M”为DL2000 DNA marker；“+”为阳性对照；“1”为样品

大肠杆菌有菌体(O)抗原、表面(K)抗原和鞭毛(H)抗原3种，已知大肠杆菌173种，K抗原103种，H抗原64种，因而构成多种血清型。根据血清型不同，分为肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒素性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)[1]。EHEC是近几年来新发现的菌株，其主型为O157:H7，主要引起人腹泻。

4.2 细菌测序分析

调查对象为我院2013级三年制护理专业学生262人，18～21岁，男11人，女251人。均于2013—2014年第一学期由同一位教师用相同教学方法教授护理礼仪与人际沟通课程，共32学时。教师在教学中根据章节特点，综合运用多种教学方法，主要包括讲授法、案例分析讨论、角色扮演、护士举止礼仪室内外实践练习、小组举止礼仪展示、情景模拟等。因我院刚搬至新校区，多媒体教室、形体房尚未装修完工，本学期教学中未进行多媒体授课和形体房练习。

5 结论

3.2 镜检病变

图10 系统进化树

6 分析

4.1 病毒检测结果

剖检送检病死牛，采集组织器官病料(脑、肝、肾、脾、淋巴结及扁桃体)研磨，提取DNA，检测牛病毒性腹泻—黏膜病病毒(BVDV)，检测结果显示，送检的病料样品中未检出BVDV(图9)。同时无菌采取肠道、肺及肝组织，划线接种于LB培养基后于37℃培养箱中培养24 h后发现，优势菌落明显，在平板上可见大小一致的菌落，培养48 h后挑取菌落涂片后经革兰氏染色为阴性[4]，随后用16S细菌通用引物鉴定，并做测序分析。

收入的样本数据目标是32例行髋关节置换的老年糖尿病患者，该次实验分组研究依据是不同护理干预模式，一组入组患者16例，参照组，男性患者和女性患者之间比例是8:8，年龄范围在61～82岁间，中位年龄数值（70.52±5.55）岁，最长病程20年，最短病程2年，中位病程（10.54±1.98）年；实验组，男性患者和女性患者之间比例是9:7，年龄范围在62～83岁间，中位年龄数值（71.55±6.01）岁，最长病程 19年，最短病程 1年，中位病程（10.01±3.22）年。验证对比实验组与参照组行髋关节置换的老年糖尿病患者一般资料，差异无统计学意义（P＞0.05）。

LEE毒力岛包含紧密素(intimin)、III型分泌系统、分泌蛋白(Esp)和紧密素的受体Tir等基因。紧密素，一个由eae基因编码的94KD的外膜蛋白，负责在细菌和肠膜间的紧密黏附。aEPEC血清型O157:H16菌株是个例外，不是所有O157:H16菌株都含有eae基因，因此，有些菌株不能合成紧密素，这表明这些菌株不具有完整的毒力岛结构。从严格意义上讲，O157:H16菌株不属于EPEC，它与EHEC的亲缘关系更近。

目前，aEPEC菌株的致病机理还不十分清楚，本文只对致病牛的病理学病变进行了观察，并对其核酸序列进行了分析。国外有学者也只是调查其流行病学，研究表明，禽源和猪源是牛感染aEPEC的主要传染源，而且也是人类感染aEPEC的主要传染源，因此，加强动物源性aEPEC的预防与控制是防控牛和人类腹泻的重要途径[3]。

一般情况下，机体因环境、应激和病毒感染等诱发因素影响，容易继发大肠杆菌[4]。我们通过做病原学检测，排除病毒感染的影响，经回访得知，该场发病的犊牛刚从外地运输回来，在加上饲养环境条件差，导致犊牛大肠杆菌病爆发。

预防措施通过平时消毒和用药预防，犊牛出生后1～3 d，头孢噻呋钠每天1次肌肉注射，防治大肠杆菌早期感染；出生后7～12 d，口服硫酸新霉素，预防犊牛白痢。治疗措施：病牛肌肉头孢噻呋钠10～20 mg/kg体重或氟苯尼考20 mg/kg体重，每日1次肌肉注射，连用3～4 d。

[1] 陈溥言.兽医传染病[M].北京:中国农业出版社,2006:111-118.

[2] 陈爱平,陈建辉,杨劲松,福建省非典型肠致病性大肠杆菌(aEPEC)的发现及某些分子特征的研究[J].中国人兽共患病学报,2011,27(4):275-278.

[3] 陈双艳,一株大肠杆菌0104的表型及基因型鉴定[D].大理学院,2013.

[4] 崔一晨,非典型肠致病性大肠杆菌流行病学调查与特性研究[D].扬州:扬州大学,2009.

IsolationandIdentificationofAtypicalEnteropathogenicEscherichiaColiandPathologicalObservationofClinicalCases

LIU Peng, CHENG Zi-long, CHEN Meng, LIU Si-dang

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShandongAgricultureUniversity,Tai’an,Shandong, 271000,China)

In June 2016, in Shangdong province, some calf of Taian’s herd, had persistent diarrhea. [Objective] The aim of this study was to detect the cause of this disease.[Method] Based on the clinical symptoms, the pathological autopsy was used to detect these samples, and some effective measures were taken.[Result] According to the histopathological observation, it was found that bovines defecated yellow watery diarrhea at first, followed by bloody diarrhea, and soon died. By pathologic autopsy, pathological observation and pathogen detection, main necropsy lesions were the liver adhesions with peritoneum, the enlargement of dark purple spleen, bleeding intestinal serosa and intra-peritoneal fluid; microscopic lesions were interstitial pneumonia, hemorrhagic deterioration nephritis, septic spleen, serous inflammation and deterioration myocarditis. In addition, based on the BLAST search results by using the National Center for Biotechnology Information (NCBI), it was showed that the serotypes of this strain E.coli are very close with the O157:H16 strain. [Conclusion] Finally, it diagnosed as the infection of atypical enteropathogenic Escherichia Coli (aEPEC). Importantly, by taking comprehensive control measures, injecting ceftiofur sodium and oral neomycin and others, the state of an illness can be quickly restored.

atypical enteropathogenic Escherichia Coli; calf; hemorrhagic peritonitis; pathological observation

2017-03-20接收日期2017-05-25

山东省牛产业技术体系资助(SDAIT-09-04)

刘朋(1991-)，男，山东章丘市人，在读硕士，主要从事动物临床病理学研究。

S823

A

1001-9111(2017)04-0042-03