牛κ酪蛋白基因变异及其与奶用性状的关系

祁 宏,苗永旺＊,2

(1.云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明 650201;2.云南大学云南省生物资源保护与利用重点实验室,云南昆明 650091)

κ酪蛋白是最重要的酪蛋白之一,它不仅在酪蛋白微团的稳定性方面起至关重要的作用,而且对奶牛泌乳性能及乳成分组成和奶酪品质均有一定程度的影响。牛κ酪蛋白由169个氨基酸残基组成,其编码基因从转录起始位点算起有近13 kb,由5个外显子和4个内含子构成。牛κ酪蛋白共发现有11种变异体,均由核苷酸非同义替换造成。许多研究结果表明,牛κ酪蛋白基因可能会影响乳牛的产奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳脂率和乳蛋白率,而且对牛乳的凝固特性和奶酪产量有显著影响。牛κ酪蛋白变异体之间对奶酪生产的影响可能是由编码序列的多态性引起的,而泌乳性状与κ酪蛋白基因型之间的关系可以用基因调控区存在突变来解释。

牛乳中含有大量蛋白质,其中酪蛋白约占牛乳总蛋白的80%[1]。κ酪蛋白是最重要的酪蛋白之一。牛κ酪蛋白(kappa-casein,κ-CN,CSN3)家族的参比蛋白是κ-CN A-1P,其 ExPASy登录名为CASK Bovin,登录号为P02668。它由169个氨基酸残基组成 ,富含 Pro、Gln、Thr、Ala等氨基酸,分子量为19 037,其信号肽由 21个氨基酸残基组成[2]。凝乳酶可水解κ-CN 105和106位点之间的肽键,其产物为侧κ酪蛋白和巨肽[3],此反应可使牛乳凝固[4]。侧κ酪蛋白是疏水的,而巨肽是亲水的。κ-CN的疏水部分与牛乳中三种钙敏感酪蛋白(α s1,α s2,β酪蛋白)结合,而亲水部分则暴露在牛乳酪蛋白微团的外面。正是这种两性电解质的特性,使得κ-CN在形成酪蛋白微团的过程中发挥着重要的作用。同时,也正是由于具有这一重要的功能,此水解位点及κ-CN在进化上相对比较保守[5]。κ-CN不仅在酪蛋白微团的稳定性方面起至关重要的作用,而且对奶牛泌乳性能及乳成分组成和奶酪品质均有一定程度的影响。但是这些方面的研究结果不尽一致,而且对它们的作用机理尚无深入研究。

1 κ酪蛋白的基因结构

牛κ酪蛋白基因(CSN3)的cDNA序列和核苷酸全序列分别于 1984年和 1988年被公布。牛CSN3的开放阅读框包含573个核苷酸[6]。CSN3从转录起始位点算起有近13 kb,由5个外显子和4个内含子构成。第 1外显子由5′非翻译区(Untranslated Region,UT R)的65个核苷酸构成,第2外显子包含5′-UTR的后5个核苷酸并且编码前导肽氨基酸的前19个氨基酸,第3外显子仅有33个核苷酸,第4外显子除编码成熟蛋白质中剩余的氨基酸外还包括3′-UTR的37个核苷酸,剩余的173个核苷酸在第5外显子之中。CSN3各内含子长度分别为2.5 kb,5.8 kb,2.0 kb和1.8 kb。在其第2和第3内含子中有7个偶蹄兽Alu样重复序列A家族序列和1个C家族序列。与这些重复序列和外显子相比,内含子的其余部分富含AT。CSN3 5′侧翼序列包含TATA框和CAAT框,在-54开始的区域内存在与转录因子AP-1(Activator Protein l)识别序列相似的序列,在第4外显子上游区也有其它可能的调控序列[7]。

2 κ酪蛋白的基因多态性

Farrell等(2004)在牛乳蛋白多态性命名的最新修订版中提出,牛属动物的κ酪蛋白共发现有11种变异体[2],各变异体名称及其在蛋白质和DNA上的对应关系见表1。κ-CN最常见的两个遗传变异体是A和B,它们在136和148位氨基酸有差别,A的两位点分别为Thr和Asp,而B为Ile和Ala[8],相应的核苷酸替换分别为ACC※ATC和GAT※GCT。C变异体于1979年被 Di Stasio发现,E变异体于1989年被 Erhardt发现[9]。Miranda等[10]指出C的97位为His,E的155位为Gly,而A在这两位点分别为Arg和Ser,相应的核苷酸替换分别为CGT※CAT和AGC※GGC。Seibert等[11]通过对脱脂牛乳进行等电聚焦(Isoelectric Focusing,IEF),发现了κ-CN D,但后来经证实其为κ-CN C。这提醒人们要鉴定所有的κ-CN变异体光靠电泳技术是不够的,需要测定其氨基酸序列或编码基因核苷酸序列才能正确区分所有的变异体,后来的变异体多是采用PCR技术结合其它技术发现的。1992年Sulimova等在瘤牛中发现F1变异体,它的148位氨基酸为Val[2]。Erhardt[9]通过IEF和碱性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE)在Pinzgauer牛中发现G1变异体。随后Prinzenberg等[12]用 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)技术把 CSN3F2和CSN3G1与其它变异体区别开来。测序结果表明,CSN3F2存在的突变位点为G10530A,CSN3G1存在的突变位点为C10790T;由此推测CSN3F2的第10位氨基酸由Arg变为His,CSN3G1的第97位氨基酸由Arg变为Cys。Sulimova等[13]通过相同方法在牦牛和欧洲野牛群中发现CSN3G2,其与A的区别在于它的148位氨基酸为Ala,其核苷酸替换为GAT※GCT。Prinzenberg等[14]通过高分辨率SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)法鉴定了新的多态体H和I,经测序推导出的氨基酸序列显示,H的135位为Ile,I的104位为Ala,其相应的核苷酸替换分别为ACC※ATC和TCA※GCA。Mahé等[15]从非洲的 Baoulé牛中发现了 κ-CN J变异体,它与B变异体的差别在于其155位氨基酸为Arg,而B为Ser。由上可知,κ-CN的变异体都是由非同义核苷酸替换造成,而不存在缺失或插入的情况,核苷酸非同义替换导致了编码氨基酸的改变。

表1 已发现的牛κ酪蛋白变异体

3 κ酪蛋白基因多态性与奶用性状的相关性

自发现牛κ酪蛋白有遗传变异体以来,各国学者就一直试图寻找其基因型和生产性状之间的联系。牛CSN3第4外显子因编码约94%的成熟蛋白质,而成为众多学者研究的焦点。其与泌乳性能及乳成分组成之间的关联性研究,多采用 PCRRFLP技术分型并结合统计模型分析的方法。已有的关于其基因分型及不同基因型对相关性状影响的研究结果见表2。赵春江等[16]认为乳蛋白基因位点效应对产奶量的影响不显著,且CSN3与乳成份没有显著相关。Lara等[17]发现κ-CN基因型对产奶量和乳蛋白率都有显著影响,BB型比AA型产奶量少173 kg,但乳蛋白率比AA型高0.08%,而且CSN3对乳脂率的影响不显著,但影响乳脂量。Alipanah等[18]在俄罗斯牛种中发现κ-CN BB型比AA型和AB型有更高的乳蛋白率,并指出将CSN3作为遗传标记纳入选种方案可以显著地改善牛群的乳品特征。Rachagani等[19]对 252头印度Sahiwal牛的研究表明,κ-CN BB型有更高的产奶量、非脂肪固形物产量和乳蛋白量。鞠志花[20]等结合测序结果采用PCR-RFLP检测了CSN3的多态性,提出在中国荷斯坦奶牛群体中,κ-CN B等位基因可作为改良奶牛乳脂率性状的分子遗传标记。本文作者用酶切软件分析了GenBank中具有代表性的两条序列AY380228(A等位基因)和 AY380229(B等位基因),发现TaqⅠ是针对引起136位氨基酸变异的核苷酸突变的,HidⅢ和HinfⅠ是针对引起148位氨基酸变异的核苷酸突变的,而PstⅠ是针对编码168位Ala的核苷酸同义突变位点;并且发现3个位点的酶切多态性是紧密连锁的。因此,各研究扩增片段和所用酶虽不尽相同,但并不影响基因型的判断。Tsiaras[21]等研究结果显示,AB型κ-CN在奶蛋白产量和含量上显著地高于AA型,而且AB型有更高的产奶量和乳脂量;但是κ-CN对繁殖性能并没有影响。由此在品种的选育过程中,可选择对产奶性状有利的乳蛋白类型,且不会对乳牛的生产繁殖性能产生负面影响。

表2 牛κ酪蛋白基因分型及与泌乳性状的关联研究

关于κ酪蛋白对奶酪生产方面影响的报道也较多。Marziali[22]等报道BB型κ-CN乳样中的总固型物质、脂肪和蛋白质含量最高,是生产奶酪的最理想原料。Eenennaam[23]等通过凝乳酶水解、PAGE检测以及光密度扫描等方法巧妙地揭示出在AB型杂合体牛中,B等位基因κ酪蛋白比A等位基因κ酪蛋白在乳样中的含量更高,即表明B等位基因可提高乳中κ-CN的表达。Wedholm等[24]分析显示凝固性差的和不凝固的乳样都与低浓度的κ-CN及其在总酪蛋白中所占的比率低有关。还有,AB型κ-CN牛的乳样比AA型的有更高的κ-CN浓度,而AB和AE型以及AA和AE型之间则无显著差异。此外,他们还提出,酪蛋白在乳蛋白中的高比率显著地有利于蛋白质到奶酪的转化。总之,众多研究表明,BB型κ-CN牛乳不仅凝乳时间短,凝块硬度大,而且奶酪产量高,极其适合制作奶酪。

4 κ酪蛋白基因影响奶牛性状表现的可能机制

乳蛋白变异体之间理化性质上的差异可能是由其蛋白质组成所引起的,而蛋白质组成的不同又是由编码序列的多态性决定的。Plowman等[25]研究了含有κ-CN C变异体的牛乳比含有A和B变异体的牛乳凝乳时间更长的原因,认为是κ-CN C变异体第97位氨基酸His改变了其空间构象,从而使它与凝乳酶的结合不紧密,所以凝乳酶对其切割比较缓慢。κ-CN A和B变异体之间对奶酪生产的影响机理也可能与此类似。

κ酪蛋白基因型与泌乳性状间的关联性可以用基因调控区存在突变位点来解释。Schild等[26]分析了7个牛种13头奶牛CSN 3 5′侧翼区约1 kb的序列,发现15个单核苷酸替换,有一些位于几个可能的调控蛋白,如 MGF(Mammary Gland Factor)、HNF3(Hepatocyte Nuclear Factor 3)、GR(Glucocorticoid Receptor)、OCT1(Octamer Binding Factor l)、PMF(Pregnancy-specific Mammary Nuclear Factor)、AP2(Activator Protein-2)等的结合位点,认为这正是基因表达有差异的原因。除5′侧翼区外,3′非编码区也可能影响基因的表达。Debeljak等[27]通过RT-PCR和毛细管电泳定量显示κ-CN AB杂合体中 B转录本比A转录本多 13.4%。并且在CSN3的3′-UT R发现有7个多态位点,其中2个接近加尾信号序列,可能在决定polyA尾的长度中起重要作用,而polyA尾长度又会影响mRNA的稳定性。Robitaille等[28]依据κ-CN B等位基因mRNA在κ-CN总mRNA中所占的比率通过聚类分析将18头奶牛分为两组(组1为50±0.09,组2为56±1.3),然后将其与κ-CN B变异体蛋白质在κ-CN总蛋白中所占比率进行t检验,结果未发现它们之间有相关性。因此提出可能是κ-CN非编码区存在等位基因多态位点,影响基因的转录活动、剪切过程及mRNA的稳定性,从而间接影响κ-CN A、B两个等位基因的表达。

后来,人们又将目光放在了启动子区的转录因子结合位点(Transcription Factor Binding Sites,TFBS)。在理论上预测TFBS即可为以后的功能启动子研究提供最初的定位,又可证实启动子内的功能元件是增强还是抑制基因表达。Malewski[29]指出κ-CN启动子区包含以下转录因子:C/EBP(CCAAT/Enhancer Binding Protein)、CTF/NF1(CCAAT-Binding TranscriptionFactor/Nuclear Factor 1)、MAF(Mammary cell-Activating Factor)、MGF 、PMF 、YY1(Yin and Yang 1),它们中有的对转录起诱导作用,有的起抑制作用;有些是通用转录因子,有些是乳腺特异转录因子。Debeljak等[30]揭示出κ-CN启动子近侧750 bp区 TFBS的密度比-1 300 bp～-750 bp区的低,后面区域内反刍动物有3个均匀分布的信号传导与转录活化因子5(Signal Transducers and Activators of Transcription 5,STAT5)。牛 CSN3的3个 STAT5位于-1 300 nt～-1 000 nt内,其实验也证明2 064 bp长的κ-CN启动子比925 bp长的转录效率更高。

也有学者探究了κ-CN启动子区与编码区之间单倍型的关系。Kaminski[31]研究证实κ-CN启动子区与第4外显子区存在基因内单倍型,而且与乳蛋白率显著相关。Keating等[32]研究了9个牛品种κ-CN的启动子区,发现有三个多态位点,-514,-426和-384(T/G,T/C和T/C),它们之间是连锁的。同时他们也对κ-CN的第4外显子进行了分型,并没有发现启动子区与编码区存在明显的连锁。虽然这三个多态位点位于 TFBS内,但是它们对各项产奶指标均无影响。不过他们也并不排除κ-CN启动子区单倍型与影响奶质的其他基因存在连锁的可能性。

5 展望

许多研究成果表明κ-CN基因和与泌乳性能及乳成分之间存在一定的相关性,但是结果不尽一致,究其原因可能有以下几点:①所研究的品种及其所处地域不同;②影响奶牛泌乳性状的各基因之间存在连锁,有些可能是κ-CN连锁基因的效应而并非它本身的效应;③不同的调控元件变异体可与相同的表达蛋白变异体组成基因内单倍型,光研究编码区可能得不出正确结论;④所选择统计模型的不同、样本量差异等人为因素也影响结果。

基因表达受不同水平一系列复杂机制的控制,如基因激活及转录起始,mRNA加工与转运,mRNA的稳定性,mRNA的翻译效率及翻译后修饰等。基因表达主要在转录水平被调控,但现在对CSN3转录调控的研究还不够充分,需继续深入研究。此外,对CSN3的研究主要集中在第4外显子区,还需要对其它外显子及内含子甚至整个基因,特别是本文提到的几处可能调控区进行深入分析,发现其多态性并揭示它们与产奶性状之间的关系。

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