藏猪肺炎支原体灭活疫苗的初步研制

索朗德吉

摘要：猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体引起的一种慢性呼吸道传染病 ， 又称猪气喘病和猪地方流行性肺炎 ， 广泛流行于世界各养猪国家和地区 ， 是一种顽固性慢性传染病。临床表现咳嗽和气喘，患病动物体温、食欲变化不明显，剖检可见肺脏心叶、中间叶和尖叶有融合性支气管炎，呈现肉样或肝样病变 。国内猪支原体肺炎的发病率为30%～50%，而感染率高达 85% 以上。猪支原体肺炎的预防、控制和净化须采取早期诊断、及时隔离、抗生素治疗或淘汰病猪、疫苗接种、全进全出、严格消毒等综合性措施，其中疫苗预防起着关键性作用。大量研究已经证实了支原体疫苗带来的经济效益，使用肺炎支原体疫苗可以降低肺炎发生率和与肺炎支原体感染有关的经济损失，在感染严重的猪场其效益和成本的比例可以达到 5：1。

关键词：猪肺疫、支原体、灭活疫苗

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

藏猪肺炎支原体Y98冻干菌株，购自中国兽药监察所。 藏猪支原体SCO2株、SCO6株、SCO1株和SC39株，西藏大学农牧学院动物医学农牧学院第一实验楼实验室由林芝藏猪殖场自然发病藏猪的非典型肺炎病变的肺脏分离并鉴定。

1.1.2支原体培养基

1.采用改良km2培养基（Thiaucourt，1996），调节 pH 至7.6～7.8，用0.22μm滤器过滤除菌后，加入15%无菌灭活的马血清，分装于培养瓶中，放入37℃、5% CO2中做无菌检验，无菌生长便可使用。

1.1.3佐剂

采用白油佐剂，水∶油：1：1

1.1.4试验动物

6月龄健康藏猪6只，体重约20㎏， 购自林芝实农牧学院验实验动物养殖场，经IHA检测藏猪肺炎支原体抗体为阴性。

1.2 方法

1.2.1 疫苗毒株的筛选

将藏猪肺炎支原体临床分离毒株SCO2，SCO6，SC13，SC39，分别接种于改良KM2培养基中，37℃摇床培养1～3，收集滴度均为109ccm/mL 的4个毒株培养液，各经气管接种3只6月龄、体重约20kg、经IHA检测藏猪肺炎支原体抗体为阴性的健康藏猪，只10mL;設对照组藏猪3只，气管注射 生理盐水 10mL。藏猪发热、咳嗽和呼吸困难等临床症状。攻毒30d后剖杀全部藏猪，观察病理变化。

1.2.2 藏猪肺炎支原体抗原的制备

筛选出的强毒株，按2%的种子量接种于含15%血清的改良km₂培养基中，37℃摇培养1～3d的肉眼察培养物生长旺盛，pH降到7.0左右时，无菌抽样进行纯粹检验和活菌滴度测定，当生长滴度达109CCU/mL以上才能用作制苗菌液。将检验合格抗原培养物，10000m/min离心30min，沉淀用PBS溶解，将抗原浓缩20倍。

1.2.3 藏肺炎支原体的灭活

按浓缩抗原总量加入0.2%甲醛溶液，充分混匀，室温（18%～20%）灭活24h，期间摇瓶4～5次，活后的培养物作10稀释后接种于含15%马血清的改良km2培位注射生理盐水4mL/只。观察15d，测定体温，记录临床反应。藏猪安全试验：选用 6 月龄、体重约20kg健康藏猪7只，分成3组，第1组3只，颈部皮下注射疫苗5.0mL/只;第2组3只，颈部皮下注射疫苗10.0/只;第3组1只，颈部皮下注射生理盐水1.0mL/作为对照。连续观察15d，测定体温，记录临床反应。

2  藏猪肺炎支原体灭活苗安全有效性及攻毒试验

2.1  病原的扩大培养

比较后最终选定km2培养基，参照液体培养基的制作方法，按使用说明书制作添加56℃30分钟灭能的猪血清、[6] 青霉素G钠（AR）、酚红（AR）调至pH7.6的km₂培养基用于分离猪肺炎支原体。未用完的未添加56℃30分钟灭能的猪血清、青霉素G钠（AR）、酚红（AR）肉汤培养基配制完毕保存于﹣20℃，每批取样作无菌检验，时间超过一周时过滤除菌，确保无菌，使用时灭菌，然后添加56℃30分钟灭能的猪血清、青霉素G钠（AR）、酚红（AR）。将病健交界处的肺组织剪碎后置于4mIEP管内已经配制好的培养基中，在37℃和5%CO₂条件下持续培养，设对照组培养基不加肺组织，至培养基颜色变黄开始传代，盲传三代或以上用于菌液PCR鉴定和其他后续试验。经培养、浓缩至抗原浓度为2×101OCCU/mL、灭活、乳化后制备成藏猪肺炎支原体 疫 苗。 用 1.0mL 吸 管 （下 口 内 径 为 1.2mm，上口内径为 2.7mm）吸取 25℃ 左右的疫苗1.0mL，令其垂直 自 然流出，流 出 0.4mL 所需的时间为9s。

2.2无菌检验

将疫苗接种于普通营养琼脂培养基和改良马丁肉汤培养基，37℃、5%5C2养3～7d，观察均无微生物生长。

2.3灭活苗安全性检验

接种疫苗后试验藏猪精神、食欲正常，在接种后2～3d试验藏猪体温升高.5℃。连续观察15d，藏猪全部健康存活，注射部位均正常，未见红肿、化脓现象。

3 结果与讨论

3.1 结果

成功分离处藏猪肺炎支原体本地毒株，命名为LZ-1，所制备的灭活苗. 经过无菌检验，攻毒保护试验和安全检验，所制备的灭活疫苗均符合要求。

藏猪肺炎支原体引起藏猪支原体肺炎流行范围广，危害严重。因此，开展藏猪肺炎支原体疫苗的研究十分必要。本试验分别以4株藏猪肺炎支原体临床分离株对藏猪进行攻毒，通过比较临床症状和病理变化的程度，筛选出强毒株 SOC2株，并用该强毒株制备油佐剂疫苗，过试验证明该疫苗有良好的保护性。疫苗的免疫效果与抗原的浓度有关。两种藏猪肺炎支原体常用培养基，即 FM-4和改良km₂培养基，分别对藏猪肺炎支原体进行培养发现，改良km₂培养基培养藏猪肺炎支原体的速度快、抗原浓度高，通过测定其抗原滴度发现，36h 的 培 养 物 浓 度 可 达 到 109 CCU/mL，比FM-4培养基更适宜藏猪肺炎支原体的培养。因此本试验选择改良km₂培养基用于疫苗的生产，收集生长滴度达到109 CCU/mL 以上的培物，并且将其浓缩20倍，即制备疫苗所用抗原浓度为2×1010CCU/mL，以此提高疫苗的保护作用。

参考文献

[1]徐叔云，等。药理学实验方法学，第二版，人民卫生出版社，1991，993-996。

[2]周爱儒，查锡良 . 生物化学 . 第五版 . 北京：人民卫生出版社，2000

[3]王世若主编 . 兽医微生物学及免疫学 . 长春：吉林科学技术出版社，1990