关于生鲜乳中黄曲霉毒素M1的方法研究

郭琦

摘要：本文主要采用高效液相色谱法对生鲜乳当中的黄曲霉毒素M1含量进行测定。在实际测定过程中，方法的回收率不高，需要对净化过程进行前处理改进，制作泵流操作架以适应免疫亲和柱达到更高效的净化效率，以此来有效开展定量和定性分析，并准确测定生鲜乳当中的黄曲霉毒素M1含量。根据试验结果可以表明，待测组分标准系列工作溶液具有良好的线性关系，其加标回收率可以达到95.00%-105.00%，而相对标准偏差则为050%-2.00%。由此可以看出，对此种测定方法进行采用，具有良好的准确度和精密度，可以在生鲜乳中黄曲霉毒素M1含量检测进行推广与应用。

关键词：生鲜乳;黄曲霉毒素M1;含量测定;泵流操作架;高效液相色谱法

前言

黄曲霉毒素作为全世界分布范围最为广泛的一类菌种，在我国各个省份均有分布，特别是华南地区，当地雨水多，而且气温较高，对黄曲霉的繁殖具有促进作用。对于黄曲霉毒素进行分析，其主要是黄曲霉以及寄生曲霉等所产生的一类结构相近的双呋喃类毒素，具有约20中衍生物，其中黄曲霉毒素M1便是一种羟基化衍生物。在奶牛饲养过程中，其饲料主要为农作物，而由于田间存在土壤贫瘠、病虫害、气候、倒伏、早霜以及潮湿多雨等因素，进而可能会导致农作物感染黄曲霉，当储存条件恶劣时则可能会产生黄曲霉毒素。在此情况下，奶牛对被污染的饲料进行采食，将会导致生鲜乳当中的黄曲霉毒素超标，进而威胁到人体健康。因此，需要合理采取检测方法，准确测定生鲜乳中黄曲霉毒素M1含量。

1生鲜乳中黄曲霉毒素M1免疫亲和层析净化高效液相色谱检测

生鲜乳中含有黄曲霉毒素M1的原因在于，奶牛对含黄曲霉毒素M1的饲料进行了采食。在我国最新版的食品安全标准当中明确规定了乳和乳制品当中黄曲霉毒素M1的安全限制为0.50μg/kg，一旦生鲜乳中的黄曲霉毒素M1含量超过这一标准，则会给人体造成相应的危害。因此，需要有效测定生鲜乳中黄曲霉毒素M1含量。目前，在检测黄曲霉毒素M1时比较常见的方法具体包括薄层层析法、高效液相色谱仪法、气质联用检测方法以及酶联免疫吸附剂测定。本文主要探讨高效液相色谱法对生鲜乳中的黄曲霉毒素M1进行测定，在实际测定过程中，相关检测人员需要采用免疫亲和柱法来选择性吸附样品提取液当中的黄曲霉毒素M1，这样可以有针对性的净化样品。当样品提取液经过亲和柱净化之后，可以利用氮吹复溶，然后进行HPLC分析。通過联合使用高效液相色谱法和免疫亲和柱法，可以实现快速准确测定目标，并使信噪比得到改善，使检测结果准确性得到提高[1]。

2生鲜乳中黄曲霉毒素M1的检测试验研究

2.1材料

2.1.1仪器设备

在本次试验当中主要使用高效液相色谱仪、荧光检测器、泵流操作架以及高速冷冻离心机等仪器。其中荧光检测器的激发波长为360nm，发射波长则为430nm。除此之外，还需要运用到色谱柱、涡旋仪、电子分析天平、移液枪、注射器、黄曲霉毒素M1免疫亲和柱、微孔针式过滤器以及气体控制装置等。

2.1.2试剂

除了有额外说明以外，本次试验当中所使用的试剂全部为色谱纯试剂和一级水，具体需要需要使用到甲醇、流动相、乙腈、黄曲霉毒素M1标准溶液和标准工作液。而在对黄曲霉毒素M1标准工作液进行制备时，需要对20.00ul的黄曲霉毒素M1标准溶液进行准确吸取，并要使用10.00%甲醇和水进行定容，并使其达到1.00mL，最终可以配制成浓度10.00ug/L的黄曲霉毒素M1标准工作液[2]。

2.2试验方法

2.2.1试验原理

针对试样当中的黄曲霉毒素M1，相关检测人员需要使用甲醇和水溶液进行提取，并要在上清液稀释之后，通过免疫亲和柱进行净化和富集。对于净化液需要进行浓缩、定容以及过滤等处理，并通过液相色谱进行分离，最后则需要使用荧光检测器进行检测和定量。

2.2.2阳性样品制备

相关检测人员需要吸取0.25mL黄曲霉毒素M1标准工作液，并使用生鲜乳进行定容，一直达到10.00mL，这样一来可以得到黄曲霉毒素M1阳性样品1，其浓度为0.25ug/kg。在这之后，相关检测人员需要对黄曲霉毒素M1标准工作液进行吸取，具体需要吸取1.00mL，同样需要使用生鲜乳进行定容，一直达到10.00mL，从而制得黄曲霉毒素M1阳性样品2，其溶度为1.00ug/kg。

2.2.3样品前处理

样品提取需要甲醇-水溶液提取，上清液必须经过大量的甲醇-水溶液稀释，总体积为50ml，由于免疫亲和柱柱容量只有2ml左右，这在净化的过程当中耗时耗力，对目标物会有损失，急需改进。方法要求稀释液转移至50ml注射器筒中，而且要控制下滴流速为1ml/min～3ml/min，进而过免疫亲和柱达到净化目的，因此，用固相萃取装置无法满足要求，需要自制一款萃取装置。

为了解决上述问题，找出解决思路，设计出了净化过程当中的泵流操作架，很好的解决了净化过程当中遇到的问题，提高了检测效率，提高了检测准确度与精密度。泵流操作架制作，黄曲霉毒素M1检测国家标准中需要50ml上样液过亲和柱，上样液量大，需要50ml注射器针筒辅助，直接过柱不易操作;并且不同生产厂家的亲和柱柱压不同，需要正压适当气流控制亲和柱过柱的流速;目前固相萃取装柱只有负压控制，流速很难控制，很容易造成流速过快。

设计三层支撑架：①能够放入50mL注射器。②注射器连接亲和柱后稳定放入架子上。③设计隔板间高度：稳定支撑注射器;放入试管后，能够很好的洗脱，不会造成试管倾斜倒下。设计加压系统：① 设计能够稳定加压，气流恒定的泵

② 设计能够塞入注射器针筒的加压塞子。③ 设计分流阀，控制多通道气流

首先，在试样准备阶段，相关检测人员需要对4.00g生鲜乳混合均匀的试样进行称取，并将其在50.00mL的离心管当中进行放置，然后向其中加入10.00mL的甲醇，并进行涡旋处理3min。在这之后，还需要在4000r/min下离心处理10min，并取出7.00mL上清液，将其在离心管当中转移，然后加入40.00mL水进行稀释[3]。

其次，试样提取和纯化。对于完成前处理的试样，需要进行纯化处理。相关检测人员需要取出免疫亲和柱，并连接一次性20.00mL注射针筒和免疫亲和柱的顶部，在气控操作装置上放置和固定免疫亲和柱。在这之后，相关检测人员需要使用移液器对47.00mL试样进行吸取，使试样进入到注射器当中，将免疫亲和柱下方堵头去掉，对开关进行调节，使试样能够按照1-2滴/s的速度流过亲和柱，完全排干样液。在排干液体之后，需要更换新的针筒，并加入2.00mL的乙腈，按照1-2滴/s的速度流过亲和柱，从而将黄曲霉毒素M1洗脱。重复上述操作两次，一直到完全排干样液。试验人员需要使用比色管收集洗脱液，并通过缓和的氮气，在一定温度条件下蒸发洗脱液，使其体积达到0.05-0.10mL，然后使用初始流动相进行溶解和定容，使其最终的体积达到1.00mL。

最后，空白试验。相关试验人员应不对试样进行称取，并按照以上步骤进行空白试验。

2.2.4测定

相关检测人员需要对浓度0.50ug/mL的黄曲霉毒素M1标准溶液称取20.00ul，然后使用10.00%甲醇水进行定容，使其达到1.00mL，配制成相应的标准工作液。在这之后，检测人员还应分别对50.00、100.00、250.00以及500.00uL的黄曲霉毒素M1标准工作液进行准确吸取，而标准工作液浓度为10.00ug/L，并使用10.00%甲醇水进行定容，从而配制出浓度分别为0.50、1.00、2.50、5.00ug/L的黄曲霉毒素M1标准系列工作液，对标准曲线进行绘制，并得到相应的线性回归方程[4]。

2.3結果与讨论

根据试验结果可以发现，通过采用免疫亲和净化高效液相色谱法对生鲜乳样品进行测定，可以得到具有良好线性的标准曲线，而且阳性样品的加标回收率可以达到95.00%-105.00%，RSD则不超过5.00%。

结束语：

综上所述，免疫亲和净化高效液相色谱法检测加标回收试验的准确性与重现性，都可以满足生鲜乳黄曲霉毒素M1含量测定要求，且测定结果准确，具有良好的重复性，因此可以在生鲜乳黄曲霉毒素M1定量检测当中进行应用。

参考文献：

[1]刘宝华，高杨. 生鲜乳中黄曲霉毒素M1检测方法的探索[J]. 中国奶牛，2017，17（3）：40-43.

[2]黄隽灏，王珉道，伍嘉耀，等. 生鲜乳中黄曲霉毒素M1检测方法研究[J]. 中国乳业，2021，32（1）：55-59.

[3]李松励，闵力，高亚男，等. 我国生鲜乳中黄曲霉毒素M1污染风险分析[J]. 动物营养学报，2018，30（12）：5202-5209.

[4]毛建霏，王加启，郑楠，等. UHPLC法测定生鲜乳中黄曲霉毒素M1及M2[J]. 中国乳品工业，2017，45（6）：45-48.