贵阳地区15种常见嗜尸性蝇类的COI序列研究

杨水滔 冯 伟 洪小霞 杨 敏 蒋廷珍 黄 江 张红玲 王启燕

贵州医科大学法医学院 贵州 贵阳 550004

在法医学死亡时间推断中,研究表明建立在尸食性昆虫基础上的死亡时间推断方法是目前较为有效的方法之一[1]。利用昆虫生态群落组成、演替规律及生长发育规律等可为推断死亡时间、死亡地点等提供信息[2-3]。在案件侦破过程中尸食性蝇类有着传统法医学无法比拟的优势。本研究对贵阳地区常见的15种嗜尸性蝇类的mtDNA中COI348bp进行检测,以探讨其用于嗜尸性蝇类种属鉴定的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 蝇类样本采集 蝇类样本采集于贵州医科大学解剖楼后楼,采集的样本由贵州医科大学法医学院外聘教授陈禄仕教授参照《中国尸食性蝇类》[4]进行形态学分类鉴定。

2 方法

2.1 DNA提取 将样本头、双翅、腹部及腿去除后取全部胸肌,按照离心柱式基因组DNA小量抽提试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)说明书提取DNA,并于-20℃保存备用。

2.2 PCR扩增

2.2.1 PCR扩增用引物 参照Sperling[5]报道所列引物进行设计。COI引物片段为C1-J-2495:5’-CAG CTA CTT TAT GAG CTT TAG G-3’;C1-N-2800:5’-CAT TTC AAG CTG TGT AAG CAT C-3’。引物由北京鼎国昌盛生物技术公司合成。

2.2.2 PCR扩增条件 利用ABI-9700型PCR(美国ABI公司)扩增仪对22个样本分别扩增348bpCOI序列。PCR扩增体系总体积50μL,其中10×PCRBuffer(with Mg2+)5μL,dNTPmix(2.5mM each)4μL,上、下游引物(10μmol/L)各2μL,Taq 酶5U/μL0.25μL,DNA模板(1μL<1μg)1.5μL,ddH2O35.25μL。反应条件为94℃5min;92℃1min,48℃1min,72℃2min,共38次循环;72℃10min。

2.2.3 PCR扩增产物的电泳检测及结果分析 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳(100V,30min),嗅化乙啶染色,紫外灯下观察。

扩增产物序列测定由上海美吉生物医药科技有限公司ABI-3730遗传分析仪测序。所有扩增产物均测双向。

测序结果用DNAMAN4.0序列分析软件进行序列拼接,NCBI中的BLAST进行序列比对及MEGA5.2软件包中ClustalW进行序列校准,MEGA5.2软件包中Kimura’s two-parameter模式分别分析尸食性蝇类mtDNA中COI348bp序列做进化距离分析,并构建系统发育树。

3 结果

3.1 碱基组成差异分析 MEGA5.2软件包对35个样本的DNA序列数据分析碱基组成,得到COI基因保守位点204个,可变位点101个,简约性信息位点95个,自裔位点6个,保守位点所占比例为66.45%,可变位点所占比例为32.90%。

3.2 距离法构建N-J系统发育树 COI基因序列运用MEGA5.2软件包中 Kimura’s two-parameter模式构建UPGMA系统发育树,结果见图1,从图中可看出亮绿蝇、丝光绿蝇、大头金蝇、宗纬别麻蝇、肥须亚麻蝇、厩腐蝇、叉丽蝇和巨尾阿丽蝇同一物种的不同样本之间均按种聚类为一支,丽蝇科的金蝇属的费曲靖与大头金蝇聚为一支,裸金蝇属的绯颜裸金蝇与金蝇属又聚为一支,最后与绿蝇属的聚为一大支;麻蝇科的别麻蝇属中的棕尾别麻蝇和台湾别麻蝇聚为一支,亚麻蝇属的肥须亚麻蝇和野亚麻蝇聚为一支。横带花蝇和斑跖黑蝇单独分支。构建的系统进化树与形态学鉴定分类的结果一致。

图1 COI基因序列构建的UPGMA进化树Fig.1 COI gene DNA sequences build the NJ evolutionary tree

3.3 种内及种间进化分歧 表1是运用MEGA5.2软件包中Kimura’s two-parameter模式对贵阳地区15种常见尸食性蝇类mtDNA上COI348bp基因序列进行分析后所建立的种内及种间进化分歧表,反应遗传进化关系。

表1 COI基因序列进化分歧表Table1 the evolutionary divergence of the DNA sequences of COI gene

从上表可以看出,在COI348bp基因序列中种内进化分歧率范围在0%-0.7%,最大种内进化分歧率出现在2个棕尾别麻蝇之间,为0.7%,最小种内进化分歧率出现在大头金蝇之间、丝光绿蝇、亮绿蝇之间;种间进化分歧率范围在3.0%-19.4%,最大种间进化分歧率出现在肥须亚麻蝇与厩腐蝇之间,为19.4%,最小种间进化分歧率出现在大头金蝇和肥躯金蝇之间为3%(见表1)。

4 讨论

用传统形态学方法鉴定嗜尸性蝇类的种属对人员要求较高,必须掌握昆虫学相关专业知识,且具有丰富的实践经验,在我国仅有少数形态学专家具备这方面的能力[6],尤其是现场收集到的昆虫学证据是蝇卵、幼虫或蛹等时期时,目前尚无系统的形态学鉴别要点。要培养至成虫进行种属鉴定耗时较长。线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)具有严格遵循母系遗传,避免双亲遗传方式引起的随机性;相对较高的碱基变化区,进化分歧率较高;基因组中不含间隔区和内含子,无重复序列、不等交换,在遗传过程中不发生基因重组、倒位、易位等突变现象,而且与核DNA相比更容易提取和分离,对样本保存条件的要求不高[7]等特点被广泛应用。适合用来对不同发育历期的尸食性昆虫进行种类鉴定[8]。课题组前期研究结果显示线粒体DNA中16SrDNA中保守位点所占比例86.1%,可变位点所占比例为13.4%,保守位点所占比例较高说明其进化速度较慢,大多数将其用于目水平上的系统发育和区系研究,少数用于科水平上的研究[9],本研究选择mtDNA中可变位点相对占比例较高(COI保守位点所占比例为66.45%,可变位点32.90%)、进化速度较快、常被用于亲缘关系较近的种、种下分类单元及地理种群之间的系统关系研究[10]的COI片段进行分析。

通过对贵阳地区15种嗜尸性蝇类的分析线粒体DNA的COI348bp序列分析,种间进化分歧率范围在3.0%-19.4%,种内范围在0%-0.7%,最大种内进化分歧率小于最小种间进化分歧率,没有交叉重叠,因此可以用于嗜尸性蝇类种属鉴定。且从遗传距离、构建的系统进化树的分析与形态学进行种属鉴定的结果一致,该方法能将本研究中的15种嗜尸性蝇类进行较好的鉴别,可以作为形态学鉴定嗜尸性蝇类种属的一个补充,对人员、实验室要求均不高,经过培训即可完成相应的工作,且该方法对现场昆虫学的证据要求不高,蝇卵、幼虫、蛹、甚至是成虫的部分翅膀、足等均可作为提取DNA的检材,因此利用推广应用。由于嗜尸性蝇类种类繁多,后续将会继续收集更多的嗜尸性蝇类进行验证。