贵州苗族线粒体DNA分析与单倍型类群探索

杨银莹 熊进军 潘胜德 杨美庆 张红玲 黄 江 任 峥

贵州医科大学法医学院 贵州 贵阳 550025

1 引言

线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是细胞核外DNA携带有编码蛋白质和RNA的基因,是人类基因组的一部分。线粒体DNA具有独特的母系遗传特征,不发生重组,能够反应一个包含众多个体的非重组母系的遗传信息,是人类的迁徙和进化研究中常用的遗传标记[1]。对于核DNA降解严重如陈旧骨骼、牙齿等,以及毛发等核DNA无法获得有效分型结果的样本,线粒体DNA分析有其独特的优势[2]。目前国际上对于线粒体DNA的序列分析通常采用全控区测序的方式[1],使用修正剑桥参考序列(revised Cambridge reference sequence,rCRs)为参考序列,本次实验研究的区域主要集中在控制区。

我国是一个多民族的国家,苗族是贵州人口最多的少数民族,在贵州有十分重要的地位,拥有其独特的历史和文化[2]。而对贵州苗族的DNA遗传标记研究已经很多,但都集中在常染色体上,线粒体DNA的研究极少,用的还是老旧的限制性片段长度多态性方法[2][3],无法适应现今的检测平台和技术要求。且提供的遗传信息极为有限,难以满足法医学和人类学研究的需求。

本文研究以贵州苗族为研究对象,通过分析其线粒体DNA,获得贵州省苗族多态性信息与法医学应用价值,为法医个体识别和亲子鉴定的证据价值提供科学的基础数据,并获得贵州苗族线粒体DNA单倍型类群分布情况。

2 材料与法

2.1 样本

2.1.1 样本来源基本情况 本实验所用血痕样本均来自贵州各地区无血缘关系的苗族个体,所有血痕样本均由贵州医科大学法医学院/法医司法鉴定中心提供。

2.1.2 样本的采集 血痕样本采集方法:以知情同意原则为前提,由贵州医科大学法医司法鉴定中心提供,无血缘关系的中国贵州苗族203名志愿者的指尖血血痕,-20℃保存。

2.2 方法

2.2.1 DNA的提取 使用盐析法[1]提取血样DNA,-20℃保存。

2.2.2 线粒体DNA控制区的PCR扩增 线粒体DNA控制区的PCR扩增以及测序引物相同,引物序列见表1:

表1 线粒体DNA控制区的PCR扩增以及测序的引物序列及浓度

根据TaKaRa LA Taq®DNA聚合酶说明书进行PCR扩增,调整PCR反体系为25μL,每个反应混合物含有0.25μL的TaKaRa LA Taq(5 U/μl),2.5μL的10×LA Taq Buffer II(Mg2+free),2.5μL的25mM MgCl2(final 2.5 mM),4μL的dNTP Mixture(2.5mM each),引物 M1-F和引物M2-R各1μL,1μL的模板DNA和12.75μL的灭菌蒸馏水。

使用ABI9700型热循环仪进行PCR扩增。每次扩增均加入1个2800M DNA做阳性对照和和1个无菌双氧水做阴性对照。在95℃预变性15min后,94℃变性1min30s,50℃复性1min30s,72℃延伸1min30s,共循环35个周期,最后继续70℃延伸10min。为了提高数据的准确度,从正向和反向两个方向对重复扩增进行测序。

使用DNAman软件(http://www.lynnon.com/)对正向和反向序列比对,与修正剑桥参考序列(revised Cambridge reference sequence,rCRs)进行比较,参照国际法医血液遗传学会DNA委员会(ISFG)推荐的命名原则进行命名。

2.2.3 线粒体统计学分析 采用直接计数法统计单倍型和单倍群频率,使用公式(1.1)[3]:

(公式中pi表示第i个单倍型的频率,k表示单倍型的数量,N表示总的样本数量。)

计算苗族mtDNA的单倍型差异度(haplotype diversity,HD)。

基于PhyloTree Build 17[4]使用Haplogrep[1]和EMMA[4]进行单倍群分配。

2 结果

2.1 单倍型 从203个贵州苗族样本中,有113个单倍型值观察到了一次,14个单倍型观察到了2次,4个单倍型观察到了3次,1个单倍型观察到了4次,2个单倍型观察到了5次,2个单倍型观察到了6次,1个单倍型观察到了7次,1个单倍型观察到了8次,1个单倍型观察到了9次。单倍型及其频率见表S1。单倍型差异度(haplotype diversity,HD)为0.9844。

2.1 单倍型类群 这203个样本被分配到71个不同的单倍群和亚单倍群,见表2。由于单倍群的分配仅依赖于控制区域的信息,因此准确性不同。单倍亚群频率最高的是B5a(29个样本,14.3%),其次是B5a1c1(14个样本,6.9%),B4k(12个样本,5.9%),D4e1a3(12个样本,5.9%),F1(11个样本,5.4%)和M74a(11个样本,5.4%)。在单倍群水平上,最常见的是B(70个样本,34.5%),其次是F(39个样本,19.2%),M(35个样本,17.2%)和D(26个样本,12.8%)。

表2 贵州苗族203个个体的单倍群频率

B 7 0 0.3 4 5 B 4 1 0.0 0 5 B 4+1 6 2 6 1 2 0.0 1 0 B 4 c 1 b 2 c 1 0.0 0 5 B 4 c 2 4 0.0 2 0 B 4 g 3 0.0 1 5 B 4 h 1 0.0 0 5 B 4 k 1 2 0.0 5 9 B 5 a 2 9 0.1 4 3 B 5 a 1 c 1 1 4 0.0 6 9 B 5 a 1 d 1 0.0 0 5 B 5 a 2 a 1 1 0.0 0 5 B 5 b 2 a 1 0.0 0 5 C 4 0.0 2 0 C 4 1 0.0 0 5 C 4 c 1 b 1 0.0 0 5 C 5 2 0.0 1 0 D 2 6 0.1 2 8 D 2 1 0.0 0 5 D 4 a 4 0.0 2 0 D 4 b 1 1 0.0 0 5 D 4 b 2 b 2 0.0 1 0 D 4 b 2 b 2 c 1 0.0 0 5 D 4 e 1 a 3 1 2 0.0 5 9 D 4 h 1 d 1 0.0 0 5 D 4 k 1 0.0 0 5 D 4 t 1 0.0 0 5 D 5 b 2 0.0 1 0 F 3 9 0.1 9 2 F 2 0.0 1 0 F 1 1 1 0.0 5 4 F 1+1 6 1 8 9 1 0.0 0 5 F 1 a 2 0.0 1 0 F 1 a 1 a 1 5 0.0 2 5 F 1 a 2 3 0.0 1 5 F 1 a 2 a 2 0.0 1 0 F 1 a 4 a 1 0.0 0 5 F 1 c 1 a 1 a 1 0.0 0 5 F 1 d 1 0.0 0 5 F 2 a 1 0.0 0 5 F 2 b 1 1 0.0 0 5 F 3 a+2 0 7 3 0.0 1 5 F 3 a 1 3 0.0 1 5 F 3 b+1 5 2 1 0.0 0 5 F 4 b 1 0.0 0 5

G 2 0.0 1 0 G 2 a+1 5 2 1 0.0 0 5 G 2 a 1 d 1 0.0 0 5 M 3 5 0.1 7 2 M 1 1 a 1 0.0 0 5 M 1 2 a 1 b 1 0.0 0 5 M 1 2 b 1 b 1 0.0 0 5 M 7 1 a 1 a 1 0.0 0 5 M 7 4 a 1 1 0.0 5 4 M 7 b 1 a 1 2 0.0 1 0 M 7 b 1 a 1+(1 6 1 9 2)5 0.0 2 5 M 7 b 1 a 1 a 1 0.0 0 5 M 7 b 1 a 1 a 3 4 0.0 2 0 M 7 b 1 a 1 b 1 0.0 0 5 M 7 c 1 a 1 a 1 0.0 0 5 M 7 c 1 a 3 1 0.0 0 5 M 8 a 2 a 1 1 0.0 0 5 M 8 a 3 a 1 0.0 0 5 M 9 3 0.0 1 5 N 8 0.0 3 9 N 9 a 1 0+1 6 3 1 1 5 0.0 2 5 N 9 a 1 0 a 1 0.0 0 5 N 9 a 1 a 1 0.0 0 5 N 9 a 2'4'5 1 0.0 0 5 R 9 0.0 4 4 R 9 b 1 a 1 a 1 0.0 0 5 R 9 b 1 b 2 0.0 1 0 R 9 c 1 a 6 0.0 3 0 Z 1 0.0 0 5 Z+1 5 2 1 0.0 0 5

3 讨论

在我们发现的所有单倍型中,其中一些被许多人共享个体,例如单倍型16140C,16183C,16189C,16266A,16519C,73G,210G,263G,523DEL,524DEL(由14个样本共享)。和单倍型多样性也低于参考人群。这种情况不是鉴于大多数苗族人集中在贵州省,这一点令人惊讶。因此,我们收集的一些样本可能属于同一母系。

由单倍群分布情况可以看出,苗族个体所属单倍群主要为B、F和M,与汉族类似,但频率分布有一定差异。因此想根据民族特有单倍群来追溯位置样本种族来源,有一定困难。但主干下属的分支单倍群,可能与汉族有一定差异。但光凭控制区测序,无法准确划分分支单倍群,需借助编码区单核苷酸多态性的分型辅助,或者全线粒体基因组测序才能完成。这一点将在后续的工作中完成。